[发明专利]一种猪流感阳性血清的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽用医药生物领域，特别涉及一种猪流感阳性血清的制备方法。

背景技术

猪流行性感冒（英文：swineinfluenza英文简称：swineflu）是猪的一种急性、传 染性呼吸器官疾病，其特征为突发，咳嗽，呼吸困难，发热及迅速转归。猪流感是猪体内因病 毒引起的呼吸系统疾病。猪流感由甲型流感病毒(A型流感病毒)引发，通常爆发于猪之间， 传染性很高但通常不会引发死亡。猪流感多被辨识为丙型流感病毒(C型流感病毒)，或者是 甲型流感病毒的亚种之一，该病毒可在猪群中造成流感暴发。

为了减少该病对养猪业造成的经济损失，猪流感疫苗的研制具有重大的意义，目 前国内猪流感灭活疫苗还处于刚刚起步阶段，有厂家刚获得新兽药证书或还在申报审核阶 段，而猪流感阳性血清的制备还处于空白阶段。

申请号CN201110356735.4的专利公开了鸡新城疫血凝抑制试验用阳性血清的制 备，申请号CN201010237919.4公开了猪瘟阳性血清的制备，申请号CN201010532340.0公开 了禽流感病毒H9亚型阳性血清的制备，目前，尚未见有猪流感阳性血清制备方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪流感阳性血清的制备方法，获得的猪流感阳性血清 可应用于毒株的鉴定和紧急免疫。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种猪流感阳性血清的制备方法，其包括步骤如下：

1)选择2～4月龄，健康、精神状态良好的鸡；

2）用猪流感灭活疫苗对鸡进行多次免疫接种：对鸡采用皮下及肌肉多点注射方式免疫 猪流感灭活疫苗，第1次免疫0.5-0.6mL，以后每隔14～15天免疫一次，每次免疫量为每只鸡 每次依上次免疫量增加0.5-0.6mL，总共免疫4次以上；

从第3次免疫开始，每次免疫前1天，采少量免疫鸡的鸡血用0.5%鸡红细胞悬液进行HI 试验（红细胞血凝抑制试验），检测HI抗体滴度，当检测到HI抗体滴度≥1:1024，用心脏采血 法对免疫鸡进行无菌采血；

3）上述步骤采血得到的鸡血在37℃环境放置2～3h，然后将鸡血移入2～8℃冰箱12～ 24h；

4）上述鸡血以3000～3500r/min的转速离心10-15min，分离收获上清液，

5）将上清液于56℃下灭活30-35min，得到灭活后的血清，过滤，得到猪流感阳性血清。

进一步，所述步骤2），猪流感灭活疫苗的制备方法如下：将猪流感病毒毒株接种9- 10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，35℃培养72h，将死胚弃去，余下的鸡胚置2-8℃冰箱保存12- 24h，收取鸡胚尿囊液并经0.20-0.22微米滤膜过滤，然后将鸡胚尿囊液超滤浓缩至HA效价 ≥2⁹，浓缩后的鸡胚尿囊液加入鸡胚尿囊液体积分数0.05%的β-丙内酯溶液，灭活后用常规 方法乳化分装，得到猪流感灭活疫苗。

所述猪流感病毒毒株为H1N1株或H3N2株。

所述步骤7），灭活后的血清用0.20-0.22微米滤膜过滤，无菌分装，得到猪流感阳 性血清。

收获的猪流感阳性血清按常规方法冻干后,抽样做无菌检验、支原体检验、HI效价 测定。将无细菌、霉菌、支原体污染且HI效价≥1:1024的猪流感阳性血清-20℃以下低温保 存。

本发明采用以上技术方案，通过猪流感灭活疫苗免疫2～4月龄鸡制备猪流感阳性 血清，减小了用猪制备阳性血清因同源动物而引起的同源其他外源病毒污染的风险，此外， 使用鸡作为实验动物跟猪相比，也降低了经济成本。本发明的猪流感病毒阳性血清（H1N1 株）与（H3N2株）血清交叉反应HI效价≤1：4。

本发明猪流感阳性血清可应用于毒株的鉴定以及紧急免疫。1、毒株鉴定：样品与 本发明方法制备的猪流感阳性血清进行HI测定，当HI效价>1：40表明该样品含本猪流感阳 性血清对应的抗原株。

2、紧急接种：采病猪鼻腔或气管拭子样本，鉴定样本中感染的猪流感病毒毒株，用 与病毒毒株对应的血清型进行免疫，每只猪免疫2～4ml。

具体实施方式

本发明猪流感阳性血清的制备方法，包括步骤如下：

1)选择2～4月龄，健康、精神状态良好的鸡；