[发明专利]一种比色检测青蒿素及其衍生物的分析方法

说明书

技术领域：

本发明属于比色分析和青蒿素及其衍生物检测技术领域，特别是涉及一种运用纳米金和 单链DNA来定性、定量的比色检测方法。

技术背景：

青蒿素是青蒿抗疟的有效成分，也是合成青蒿素系列药物的起始原料，当前青蒿素系列 药物已取代奎宁成为治疗疟疾最安全有效的药物。近年来由于青蒿素及其衍生物在世界范围 的广泛应用，促进了我国青蒿素提取业的快速发展，同时也带动了青蒿种植业的发展。因为 青蒿的使用量大，市场需求广，一些不法商贩也借机用劣质青蒿或伪品冒充正品出售，给青 蒿素提取厂商带来了很大的损失，因此建立青蒿素定性以及定量检测方法显得尤为重要。当 前青蒿素的检测方法包括生物学方法、光谱分析法、色谱分析法等。生物学方法如酶联免疫 法(ELISA法)、放射免疫分析法(RIA法)，在定量分析青蒿素时通常会遇到成本高、操作复 杂等问题，不具有普遍性。光谱分析法如紫外光谱分析法，存在操作步骤烦琐、费时的缺点。 色谱分析法如高效液相色谱法，虽具有准确度高、专属性强、结果准确等优点，但因仪器昂 贵，成本太高而不能普及和推广。因此，建立一种快速、简便、准确、灵敏的青蒿素检测方 法势在必行。

近年来，随着新型纳米材料的不断出现，便携、实时、低成本的检测技术和装备迅速发 展起来。其中，金纳米粒子因其特殊的物理化学性质而收到广泛关注和应用。纳米金是指直 径在0.5-250nm的金超微粒子，一般分散在水中。Mirkin等首次将纳米金比色测定法应用于 生理活性物质分析，利用纳米金溶液在聚集和解聚集过程中所产生的颜色变化，发展了肉眼 可视化分析检测寡聚核苷酸杂交的DNA生物传感器。这种基于纳米金的裸眼可视化检测方 法，其具有方便、快捷、灵敏度高、低成本、仪器简单等显著优点，因而更适合于现场筛查 和现代社会对分析检测技术的需求。迄今为止，将纳米金用于青蒿素及其衍生物的可视化检 测研究还未见报道。

青蒿素及其衍生物含有过氧桥基团，可与亚铁反应后可生成高活性自由基，破坏单链 DNA的结构，而单链DNA对纳米金可起稳定作用。本发明基于这些研究，通过青蒿素及其 衍生物与亚铁反应生成自由基，破坏单链DNA，使其丧失对纳米金的保护作用，使分散的纳 米金聚集，颜色由酒红色变为蓝紫色，达到裸眼检测青蒿素及其衍生物的目的。纳米金溶液 颜色的变化对应于吸光度的变化，纳米金聚集使特征吸收峰红移，以吸光度比值对浓度做标 准曲线，从而建立一种基于纳米金比色检测青蒿素及其衍生物的分析方法。

发明内容：

本发明的目的在于克服当下青蒿素及其衍生物检测过程中存在的操作繁琐费时、成本昂 贵、依赖大型仪器设备等问题，提供了一种基于纳米金的新型比色检测方法，利用了纳米金 独特的光学特性及青蒿素的特殊结构，构建了一个简单快速灵敏的检测体系。纳米金胶体分 散状态时呈酒红色，聚集后呈蓝紫色，单链DNA可防止纳米金在亚铁离子溶液中聚集，从 而对纳米金胶体起到保护作用。而青蒿素或其衍生物在亚铁离子催化下可产生自由基，破坏 单链DNA结构，使其丧失对纳米金的保护，进而使纳米金聚集变色，实现对青蒿素及其衍 生物的比色检测。所述的技术方案如下：

本发明所涉及的比色检测青蒿素及其衍生物的分析方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)分别向A、B离心管中加入单链DNA溶液；

(2)向步骤(1)中得到的B离心管溶液加入含有青蒿素或其衍生物的丙酮溶液，A离心管 加入等量丙酮溶液；

(3)向步骤(2)中得到的A、B离心管溶液分别加入亚铁离子溶液并混合均匀，反应一段 时间，当青蒿素或其衍生物存在时将反应产生自由基，从而破坏单链DNA，若不存在则没有 自由基产生，单链DNA结构保持完整；

(4)向步骤(3)中得到的A、B离心管溶液分别加入纳米金胶体溶液并混合均匀，观察到B 离心管中混合物颜色由酒红色变为蓝紫色，即指示了青蒿素或其衍生物的存在；而A离心管 混合物中不存在青蒿素或其衍生物，没有自由基产生，纳米金胶体得到了结构完整的单链 DNA的保护，保持分散状态的酒红色；

(5)通过紫外分光光度计测定A、B离心管溶液的吸光度，当B离心管溶液有青蒿素或 其衍生物存在时吸收峰红移；

(6)配制梯度浓度的青蒿素或其衍生物的标准溶液，经过上述步骤后依次测定吸光度， 以吸光度比值对浓度绘制标准曲线，利用该标准曲线实现对样品中青蒿素或其衍生物的含量 测定。