[发明专利]一种石斛胚状体规模培养方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织工程技术领域。本发明涉及一种植物生物技术克隆工程，特别是针对像铁皮石斛这种药用价值很高却生长缓慢、产量极低、对环境条件要求十分苛刻的濒危物种，以及对土地破坏比较严重，例如甘草等植物。

背景技术

随着城市化进程的迅速发展和人口的不断增长，生态环境的不断退化，使许多名贵中药材资源枯竭和濒灭。特别是针对像铁皮石斛这种药用价值很高却生长缓慢、产量极低、对环境条件要求十分苛刻的濒危物种，其社会效益很大。另一方面，由污染导致的食品安全问题已非常严重，农药残留和重金属超标是中草药植物的一大问题，也亟需解决。

铁皮石斛，顾名思义，是专指生于岩石上的石斛。至于附生于树木上的石斛属植物，古代本草亦有记载，称之为木斛。《本草经集注》曰：“生栎树上者名木斛，其茎形长大而色浅。……今始安亦出木斛，至虚长，不入丸散”。《本草图经》曰：“惟生石上者胜。亦有生栎木上者，名木斛，不堪用。”目前广泛培养于木屑之上的木斛，药性甚微，而且大面积占用土地。虽然从上个世纪80年代开始，人们试图用种子繁殖，人工栽培等手段或通过组织培养，诱导种子原茎球来扩增植株，再进行人工引种栽培等方法，扩大铁皮石斛的生产。该方法目前已经比较成熟，但由于种植者对医书中描述的铁皮石斛种植方式的了解不够，绝大部分种植者都种植木斛，其药用价值大打折扣，而且利用有性繁殖产生种子，经发芽扩增的方法很容易造成变种，对石斛物种的纯度造成很大的威胁。

本发明根据高等植物细胞的两个全能性：植物细胞具有分化成完整植株的全能性和植物细胞能合成原生植株药用有效成份的全能性。针对铁皮石斛这一具体物种，发明了一整套从铁皮石斛原生植株成株茎段休眠芽上直接诱导出胚状体，利用组织工程技术对铁皮石斛进行扩增，通过调整培养基成分将胚状体进行悬浮培养，进而将该方法与人工光源相结合，利用控制温度、酸碱度、氧含量、以及生长调节剂比例等将生产规模扩大到吨级以上的规模。

利用本发明的铁皮石斛胚状体规模培养方法，其生长速率达到8-9.5毫克/克·天；相当于自然生长速度的1000倍以上。利用规模化培养基础罐(500升)每25-50天产量可达20公斤干品，扩增产能每罐得率均在3.5％以上，得干率lO％以上。通过实施本发明的技术方法，使铁皮石斛的生物培养规模从土地种植的低水平向工厂化生产规模转化。同时，由于生产流程得到了良好的控制，使农残重金属几乎检测不到，大大提高了产品长期服用的安全性。

发明内容

本发明为一种体外规模化悬浮培养扩增石斛胚状体方法，其培养过程是：石斛带休眠芽茎段，插入到适宜固体培养基上，在合适的培养温度和光照强度下，待起始胚状体长出后，将胚状体剥离，置于相同的上述培养基上扩增，扩增后转入到上述培养基去掉琼脂粉的液体培养基中，置于摇床上90-120转/分振荡悬浮培养，每瓶按适当接种率接种，根据生长情况继代；经数次继代适应悬浮培养后，转入大规模生物反应器中进行连续扩增，通过调节生物反应器中的指标、更换培养基成分、改变生长调节剂比例、以及分批在线收集等手段，最终达到每25-50天收获一次或连续、半连续培养，多糖含量达到15％以上，比生物生长速率达8-9.5毫克/克·天，并保持20L至吨级单元生产规模、常年稳定的扩增体系。

具体的操作为：

石斛带休眠芽茎段，插入到适宜固体培养基上，在合适的培养温度和光照强度下，待起始胚状体长出后，将胚状体剥离，置于相同的上述培养基上扩增，扩增后转入到上述培养基去掉琼脂粉的液体培养基中，置于摇床上90-120转/分振荡悬浮培养，获得胚状体种子；将胚状体种子按一定接种比例接种到生物反应器中，通过调节氧含量在30-50％之间，pH为5-7，固定光源光照12-20h，光照强度2000-8000Lx，培养分阶段进行，每一阶段为10-15天，不同阶段的光质交替变换，所述的光质为红蓝光，所述的交替变换为红蓝光比例由第一阶段的2-3:4-5调整为第二阶段的3-4:4-6，再由第二阶段的3-4:4-6调整为第三阶段的2-3:4-5，并以此模式循环；每阶段更换新鲜液体培养基一次。每15-25天收获石斛胚状体培养物的30-50％，并补充相应比例的新鲜液体培养基，培养持续进行；所述液体培养基为基本培养基中添加植物生长调节剂，植物生长调节剂为生长素、细胞分裂素的组合或生长素、细胞分裂素与ABA的组合，总浓度为在0.05-5mg/L调整。

所述基本培养基为MS、1/2MS、1/4MS、B5、N6、NLN、White或SH培养基。