[发明专利]一种舒伯特气单胞菌特异性引物及其在大菱鲆养殖过程中的应用

说明书

技术领域

本发明属于病原微生物检测领域，具体涉及一种大菱鲆养殖过程中常见的致病菌：舒伯特气单胞菌(Aeromonasschubertii)的PCR检测方法。

背景技术

有“多宝鱼”之称的大菱鲆已被引进我国长达10年之久，凭借其优良的苗种，先进的创新模式和工业化养殖的潮流，逐渐成为全国引人注目的重要养鱼工业。这一全新产业的发展，对我国的水产经济拉动均有很大作用，并为我国北方沿海城市工业化养鱼的纵向发展奠定了雄厚的理论和实践基础。然而随着养殖规模的快速增长，养殖密度的增加，以及水体环境的恶化，一系列的疾病也随之而来。近年来在大菱鲆养殖过程中细菌性疾病的急剧爆发严重影响并制约了我国大菱鲆养殖产业的健康发展，给养殖户带来了巨大的经济损失。

发明内容

本发明的目的是提供一种对舒伯特气单胞菌具有特异性强且灵敏性高的特异性引物。

本发明的另一目的是提供一种在大菱鲆养殖过程中，可快速鉴定致病源，为养殖户挽回经济损失的大菱鲆养殖过程中舒伯特气单胞菌的PCR检测方法。

本发明采用的技术方案是：一种舒伯特气单胞菌特异性引物，所述的舒伯特气单胞菌特异性引物由上游引物F和下游引物R构成；

所述的上游引物F的序列为：GGGCCCGTTATGACCAGTTT；

所述的下游引物R的序列为：AGGAGTGATCTTGAGCTTGACC。

优选的，上述的一种舒伯特气单胞菌特异性引物，所述的舒伯特气单胞菌是Aeromonasschubertii。

一种大菱鲆养殖过程中舒伯特气单胞菌的PCR检测方法，方法如下：

1)提取大菱鲆病灶部位细菌的总DNA；

2)以所提取的DNA为模板，采用上述的舒伯特气单胞菌特异性引物，进行PCR扩增；

3)根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断大菱鲆是否被舒伯特气单胞菌感染；如果琼脂糖凝胶呈现结果有704bp条带产生，则大菱鲆被舒伯特气单胞菌感染，否则没有被感染。

上述的一种大菱鲆养殖过程中舒伯特气单胞菌的PCR检测方法：

PCR反应条件：第一阶段：94℃1min；

第二阶段：94℃30s，60℃1min，72℃30s；30循环；

第三阶段：72℃2min；

第四阶段：4℃保存。

本发明的有益效果是：

1.本发明，设计的舒伯特气单胞菌特异性引物，能有效从各常见致病菌株中区分出舒伯特气单胞菌，表现出很强的特异性。

2.本发明，设计的舒伯特气单胞菌特异性引物，灵敏性高，可有效检出养殖过程中的舒伯特气单胞菌，其最低检测浓度可达到10^-4ng/ul。

3.本发明，所提供的在大菱鲆养殖过程中舒伯特气单胞菌的PCR检测方法，使得养殖过程中舒伯特气单胞菌的检测更为简便。在大菱鲆养殖过程中，一旦有被气单胞菌感染的风险，即能够做到快速鉴定致病源，为养殖户挽回大量损失。本发明的检测方法可有效检出大菱鲆养殖过程中的高危致病菌舒伯特气单胞菌，经验证此检测方法特异性强，灵敏度高。该检测方法的确立为今后大菱鲆养殖过程中高发致病菌的检测和分析提供了必要的理论依据和完善的方法体系，不仅为今后大菱鲆养殖产业的健康发展做出了贡献，同时为促进我国养殖产业的规模化健康发展奠定了基础。

附图说明

图1是舒伯特气单胞菌特异性引物Sc的PCR反应条件优化；

其中，M:MarkerDL2000，1-6:退火温度分别为55，56，57，58，59，60℃。

图2是舒伯特气单胞菌特异性引物Sc的特异性验证；

其中，1.Aeromonasbivalvium；2.Aeromonascaviae；3-4.Aeromonashydrophila；

5.Aeromonasjandaei；6.Aeromonassalmonicida；7.Aeromonasschubertii；

8.Aeromonassobria；9.Aeromonasveronii；10.Pseudomonasaeruginosa；

11.Pseudomonasfragi；12.Pseudomonasgessardii；

13.Pseudomonashelmanticensis；14.Pseudomonaskilonensis；