[发明专利]基于PSA磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测分析技术和纳米生物技术领域，具体涉及一种基 于PSA磁微粒的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法和检测 方法。

背景技术

前列腺特异性抗原(prostatespecificantigen，PSA)是人类前列腺上皮产 生的一种丝氨酸蛋白酶，最早由Hara等于1971年从人类精浆中发现并命 名为精浆蛋白(gammaseminoprotein)，1979年Wang等从前列腺上皮细胞中 分离和提纯出与此完全相同的糖蛋白，且证明其是前列腺特异的，因此将 其命名为前列腺特异性抗原。

PSA是一种包含240个氨基酸的单链糖蛋白，分子量为34KD。正常前 列腺上皮、增生前列腺组织及前列腺癌细胞均能产生PSA。PSA自上述细 胞分泌后进人前列腺导管腔内，以高浓度储存，其中极少的部分进入血循 环系统，成为血清PSA。PSA在组织中的浓度是血清中的10倍。巨大浓度 差异原因在于正常的上皮细胞与毛细血管、淋巴系统之间被完整的基底细 胞层和基底膜所分隔。

在外周血中的PSA可大致分为两大类：游离PSA(fPSA)以及α-1抗凝 乳蛋白酶形成稳定复合物的结合型PSA(cPSA)。fPSA占总PSA(tPSA)的 5％-30％。

目前，前列腺特异抗原(PSA)作为一种筛选工具，已越来越普及。由 于PSA的检查，越来越多的癌肿在临床早期就被发现。通常，PSA的正常 值小于4μg/L。前列腺肥大与前列腺炎这两种良性疾病，会造成PSA升高， 浓度通常在4至10μg/L之间。如果PSA浓度大于10μg/L，发生前列腺癌 的机会就增加，要进一步做直肠超声波检查支持诊断。如果PSA大于 40μg/mL，就有可能发生晚期前列腺癌。如果前列腺癌治疗后，PSA浓度上 升，代表可能局部复发或有远处扩散的情形。但PSA有一定的漏症率，1/3 具有重要临床意义的癌症病例，必须配合直肠指检、直肠超声波检查才能 减少误诊率。其中，fPSA在良性前列腺肥大时显著增高，与单独检测tPSA 相比，检测fPSA和tPSA并计算fPSA/tPSA对鉴别良性前列腺肥大与前列 腺癌极为有利。然而，目前临床实验室不能直接获得f-PSA/t-PSA的比值， 而是分别使用f-PSA和t-PSA两种诊断试剂盒分别测定血清中f-PSA和 t-PSA水平，再计算f-PSA/t-PSA的比值，操作比较繁琐，效率低。

如中国专利文献CN102393459A中公开的一种游离前列腺特异性抗原 fPSA的定量测定试剂盒，该试剂盒包含fPSA磁分离试剂，酶反应物，反 应增强剂，稀释液，fPSA标准品、FPSA质控品，清洗液浓缩液以及底物 溶液。该试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，同时在出结果时间上相 对现有技术缩短了至少10分钟，并达到了较佳的性能参数，并且大大降低 了产品成本。上述文献中的方案仅能测定血清中的游离前列腺特异性抗原 fPSA，而对于血清中的总前列腺特异性抗原tPSA的测定则需要按照中国 专利文献CN102360011A中公开的总前列腺特异性抗原(tPSA)定量测定试 剂盒及其检测方法中的方案进行测定。上述的方案中不能同时检测tPSA和 fPSA，不仅操作繁琐，效率低，而且由于不能保证tPSA和fPSA是在相同 的条件下检测，使得检测的结果的比值存在的误差比较大，影响结果的准 确可靠性，而且由于其采用夹心法化学发光免疫分析法，例如在中国专利 文献CN102360011A中，利用单克隆抗体与酶标单克隆抗体分别与tPSA分 子的不同表位结合，同时利用酶促化学发光底物催化裂解，形成不稳定的 激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应， 即可使用发光仪检测反应的发光强度，然而上述步骤中利用酶来发光，检 测发光强度进而计算出tPSA的含量，但是由于酶对于环境的要求比较高， 且反应需要时间比较长，进而影响检测的时间以及灵敏性，效率比较低。