[发明专利]B细胞抗原受体H链CDR3的处理方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种获取作为中间结果的终末期肾脏病信息，特别是涉及一种B细胞抗原受体H链CDR3的处理方法。

背景技术

终末期肾脏病(End stage renal disease，ESRD)，指各种慢性肾脏疾病的终末阶段，与尿毒症的概念类似，只是诊断标准有所差异。一般认为当小球滤过率降至15mL/(min.1.73m²)以下时即可诊断。也就是说当慢性肾脏病到了5期时就进入了终末期肾脏病阶段。ESRD患者往往伴有免疫功能极其低下，并发严重的感染是其生活质量低下、发生死亡的主要原因，所以了解慢性肾功能不全患者不同阶段的免疫状态对指导临床具有重要意义。在ESRD患者的早期可无明显不适，但随着肾功能的进行性下降，毒素在体内进一步蓄积，可引起尿毒症的各种症状，如恶心、呕吐、胃纳差、皮肤瘙痒、口氨臭味、水肿等，并可出现贫血等一系列并发症。肾脏疾病免疫发病机制认识逐步深入，在各种肾小球疾病的发展过程中，在多种损伤因子作用下，肾脏内炎症、单核或巨噬细胞浸润，各种趋化和粘附分子释放，细胞损伤、凋亡和增生，特别是足细胞的损伤，凋亡和转分化，引起大量蛋白尿，最后导致纤维化和肾小球硬化，是肾小球疾病发展、恶化、肾功能丧失的共同途径。

近年来许多研究表明，慢性肾功能不全患者尤其发展到晚期的尿毒症阶段，由于肾功能衰竭导致体内大量毒素的蓄积是引起机体的免疫抑制的重要原因。主要引起细胞免疫的缺陷，表现为辅助性/诱导性T细胞数量减低，抑制性/细胞毒性T细胞数量相对增高，其比值减低的一种免疫抑制状态，我们知道辅助性T细胞也参与调节B细胞的分化和增殖，所以也间接的影响了体液免疫(CDl9表达低下)，导致体液免疫缺陷，抗体产生障碍。细胞与体液免疫的缺陷都可以引起患者严重感染的发生。引起免疫抑制的原因可能由于：慢性肾功 能不全患者体内脂质代谢是紊乱的，血清中抑制毒素如脂蛋白，特别是极低密度脂蛋白能改变淋巴细胞膜表面脂肪酸的结构，引起IL-2的生成减少，从而引起T细胞的增殖受到抑制，也影响了B细胞的生长和分化；而小分子的尿素氮、肌酐等亦可抑制淋巴细胞对植物血凝素的反应，使得T细胞的转化功能降低，这也是T细胞缺陷的一个重要原因。然而上述的研究并没有能完全阐明ESRD的免疫机制，治疗的手段仍没有根本变革。更为重要的是，由于ESRD是多因素的、遗传素质、性激素和环境因素等相互作用引起疾病，而且ESRD患者在体内毒素聚集后又会影响患者免疫状态。因此，从新的角度阐释ESRD的发病机制、对免疫系统影响以及寻找新的生物标志物及治疗靶点仍然是当前ESRD研究的主要目标和挑战之一。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种终末期肾脏病患者B细胞抗原受体H链CDR3的处理方法。

一种B细胞抗原受体H链CDR3的处理方法，包括以下步骤：

设置实验组与对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血标本；

分离各所述外周血标本的B细胞，并分别提取所述外周血标本B细胞中的DNA；

采用多重PCR技术，扩增出B细胞受体H链的CDR3区；

对所述B细胞受体H链的CDR3区进行高通量测序，并对所述实验组及对照组中B细胞受体H链进行数据分析。

在其中一个实施例中，采用多重PCR技术之前，所述处理方法还包括测定DNA的含量以及检测DNA完整性的步骤。

在其中一个实施例中，采用荧光分析法测定DNA的含量。

在其中一个实施例中，用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA完整性。

在其中一个实施例中，利用Illumina MiSeq平台对CDR3区进行高通量测序。

在其中一个实施例中，采用多重PCR技术，扩增出B细胞受体H链的CDR3区，包括构建DNA文库，其具体包括：

计算所述实验组及对照组中DNA的取用量，称取，并加入V区引物及J区引物多重PCR；

电泳检测回收多重PCR产物；

加入末端修护混合液进行末端修护反应，并纯化；

将纯化后的产物在3’端连上A碱基；

在接头连接反应体系中进行接头连接；

通过PCR反应富集经过接头修饰的DNA片段，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段后，纯化回收，得到DNA文库。

在其中一个实施例中，构建DNA文库后，还包括检测所述DNA文库的插入片段范围及对所述DNA文库的浓度进行定量。