[发明专利]一种提高延胡索酸产量的方法

权利要求书

1.一种丙酮酸羧化酶突变体，其特征在于，所述突变体是在氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的丙酮酸羧化酶的基础上，将第485位的精氨酸突变成为脯氨酸。

2.编码权利要求1所述的一种丙酮酸羧化酶突变体的基因，其特征在于，在SEQIDNO.2所示序列基础上将编码第485位的精氨酸的密码子修改为编码脯氨酸的密码子CCA。

3.一种表达权利要求1所述突变体的基因工程菌，其特征在于，以同时缺失了编码丙酮酸脱羧酶PDC1、乙醇脱氢酶ADH1、延胡索酸酶FUM1的基因的酿酒酵母为宿主。

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，以pY15TEF1为表达载体，表达权利要求2所述的基因。

5.一种利用权利要求3或4所述的基因工程菌发酵生产二元羧酸的方法，其特征在于，是在发酵过程中通入二氧化碳。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述二元羧酸包括延胡索酸、苹果酸、琥珀酸、α-酮戊二酸。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述二元羧酸为延胡索酸，将基因工程菌的种子液，接种至装有4L发酵培养基的7L发酵罐中，于30℃、220rpm条件下进行培养，起始OD₆₀₀＝0.2，通气量为1vvm，搅拌转速为300rpm，发酵进行到36h时，通入0.1vvm的二氧化碳。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵培养基含有：无氨基酵母氮源3.4g/L、硫酸铵5g/L、葡萄糖40g/L，亮氨酸100mg/L、色氨酸20mg/L、组氨酸20mg/L、尿嘧啶20mg/L。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在摇瓶中发酵时，添加碳酸钙5g/L；在7L发酵罐中发酵时，用2N的KOH和2N的稀硫酸来控制pH。