[发明专利]一种提高延胡索酸产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高延胡索酸产量的方法，属于遗传工程和发酵工程领域。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为一种真核模式微生物，因具有：遗传信息丰富，代谢改造操作方便；营养需求简单，分离提取工艺成本低廉；在低pH条件下(甚至pH<3.0)生长良好；能够耐受高浓度的底物；被FDA认证为GRAS(GeneralRegardedAsSafe)微生物，发酵产品具有安全性等优点而成为发酵生产羧酸(乳酸、丙酮酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等)的潜在最适微生物。然而，酿酒酵母在高浓度糖及通风的条件下分批发酵会产生大量的乙醇，对于以羧酸为目标产物的发酵来说，乙醇的大量积累使得碳流大量的损失。通过弱化乙醇途径中的关键酶的活性，可以减少通往乙醇的碳代谢流，从而减少碳流的损失；在此基础上，可通过阻止或弱化目标羧酸的进一步代谢，来构建目标羧酸的合成途径。

丙酮酸羧化酶的作用是将丙酮酸转化为草酰乙酸，进而可将碳流引入到目标羧酸的合成途径，因此，丙酮酸羧化酶的作用可形象地描述为“生物阀门”，如何强化丙酮酸羧化反应，将碳流更有效地引入到目标羧酸的合成途径，成为代谢工程改造酿酒酵母生产羧酸的一个关键问题。同时，丙酮酸羧化反应可以固定二氧化碳，从而解决环境的问题。已有研究表明细胞中丙酮酸羧化酶活性的高低对苹果酸、琥珀酸、谷氨酸的积累有着重要作用。任何以二元羧酸为目标产物的酿酒酵母发酵工艺，都将面临同样一个问题：如何强化丙酮酸羧化反应，促进碳流由丙酮酸流向目标羧酸的合成途径？如何提高丙酮酸羧化酶的活性？

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种丙酮酸羧化酶突变体。

所述突变体是在氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的亲本米根霉丙酮酸羧化酶的基础上，将第485位的精氨酸突变成为脯氨酸。

在本发明的一种实施方式中，编码所述亲本米根霉丙酮酸羧化酶的基因经密码子优化后的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种表达所述突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以酿酒酵母为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以同时缺失了编码丙酮酸脱羧酶PDC1、乙醇脱氢酶ADH1、延胡索酸酶FUM1的基因的酿酒酵母为宿主。

在本发明的一种实施方式中，以pY15TEF1为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸脱羧酶基因PDC1的核苷酸序列如GeneID:850733所示，乙醇脱氢酶基因ADH1的核苷酸序列如GeneID:854068所示，延胡索酸酶基因FUM1的核苷酸序列如GeneID:855866所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述丙酮酸羧化酶突变体的基因序列是在SEQIDNO.2所示序列基础上将编码第485位的精氨酸的密码子修改为编码脯氨酸的密码子CCA。

本发明的第三个目的是提供一种利用表达所述突变体的基因工程菌发酵生产二元羧酸的方法，是在发酵过程中通入二氧化碳。

所述二元羧酸，包括延胡索酸、苹果酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等。

在本发明的一种实施方式中，所述二元羧酸是延胡索酸。

在本发明的一种实施方式中，二氧化碳的通入量为0.1vvm。

在本发明的一种实施方式中，将过表达丙酮酸羧化酶突变体的三基因缺失菌株(SaccharomycescerevisiaeCEN.PK2-1C△PDC1△ADH1△FUM1)的种子液，接种至装有4L发酵培养基的7L发酵罐中，于30℃、220rpm条件下进行培养，起始OD₆₀₀＝0.2，通气量为1vvm，搅拌转速为300rpm,发酵进行到36h时，通入0.1vvm的二氧化碳。

在本发明的一种实施方式中，发酵培养基含有：无氨基酵母氮源3.4g/L、硫酸铵5g/L、葡萄糖40g/L，亮氨酸100mg/L、色氨酸20mg/L、组氨酸20mg/L、尿嘧啶20mg/L。如果是在摇瓶中发酵，添加碳酸钙5g/L，如果是在7L发酵罐中发酵，用2N的KOH和2N的稀硫酸来控制pH。

本发明还涉及所述突变体以及所述突变体得到的延胡索酸在食品、饲料、化工、药物制备等方面的应用。