[发明专利]10-去乙酰巴卡亭III 10β-O-乙酰转移酶突变体及其在催化合成紫杉醇及其类似物中的应用

说明书

本发明提供了10‑去乙酰巴卡亭III 10β‑O‑乙酰转移酶(DBAT)一系列突变体蛋白，这些蛋白均能专一性地将乙酰辅酶A等的酰基转移到10‑去乙酰紫杉烷的C10位羟基上，生成紫杉醇或其类似物。本发明涉及DBAT突变体的氨基酸序列以及编码这些氨基酸序列的核苷酸序列，以及DBAT突变体蛋白在利用10‑去乙酰紫杉醇等10‑去乙酰紫杉烷底物合成紫杉醇或其类似物上的应用；特别是将其与能够专一性水解7‑木糖‑10‑去乙酰紫杉醇的糖基水解酶相偶联，以7‑木糖‑10‑去乙酰紫杉醇为底物，以乙酰辅酶A为酰基供体直接合成紫杉醇。

技术领域

本发明涉及10-去乙酰巴卡亭III 10β-O-乙酰转移酶(DBAT)的一系列突变体蛋白，将来自但不限于乙酰辅酶A的酰基转移到10-去乙酰紫杉烷上，生成紫杉醇或其类似物；突变体蛋白的酰基受体包括但不限于10-去乙酰紫杉醇和10-去乙酰巴卡亭III。本发明涉及这些突变体蛋白的氨基酸序列以及编码这些氨基酸序列的核苷酸序列及其应用。

技术背景

紫杉醇(paclitaxel,)是一个具有确切抗肿瘤疗效、主要来自于红豆杉但天然含量极低的“重磅炸弹”式药物，而10-去乙酰巴卡亭III 10β-O-乙酰转移酶(DBAT)则是紫杉醇生物合成途径的一个重要酶，催化该途径的中间体10-去乙酰巴卡亭III(10-DAB)C10位上羟基的乙酰化反应，形成巴卡亭III，后者再经过若干步反应最终形成具有复杂结构的二萜类化合物——紫杉醇。

1996年，Zocher等首次报道以乙酰辅酶A为酰基供体、用来自欧洲红豆杉(Taxusbaccata)的根部(蛋白)粗提液催化10-DAB的C10位羟基乙酰化形成巴卡亭III，该粗提液显示区域选择性，即只对C10羟基具有乙酰化作用，而对于10-DAB的C1、C7和C13位的游离羟基不起作用[Zocher,R,et al.Biosynthesis of Taxol:enzymatic acetylation of 10-deacetylbaccatin-III to baccatin-III in crude extracts from roots of Taxusbaccata.Biochem Biophys Res Commun.,1996,229(1):16-20]。之后，Pennington等报道分别从东北红豆杉(Taxus cuspidata)的叶和悬浮培养细胞中得到了部分纯化的DBAT，均能在乙酰辅酶A存在的条件下催化10-DAB形成巴卡亭III；但如果以10-去乙酰紫杉醇(DT)为底物，则不能得到肯定的结果，表现在产物紫杉醇生成的不确定性、或因其产量不足而无显著性统计学意义，并认为最有可能的解释是：紫杉醇的时隐时现源于粗酶液中污染一种尚未被表征的乙酰辅酶A:10-去乙酰紫杉醇-O-乙酰转移酶[Pennington,JJ,et al.AcetylCoA:10-deacetylbaccatin-III-10-O-acetyltransferase activity in leaves andcell suspension cultures of Taxus cuspidata.Phytochemistry,1998,49(8):2261-2266]。上述两篇文献仅涉及到DBAT粗酶液，其中夹杂着其他未被表征的蛋白质(或酶)，且其中的DBAT都未被表征；反应产物的鉴定也仅限于薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)和同位素扫描，没有进行严格的波谱学证明，因此证据尚不够充分。1999年Menhard等报道从中国红豆杉(Taxus chinensis)的悬浮细胞中纯化到DBAT，该酶为单体蛋白，表观分子量为71±1.5kDa，最适pH和最适温度分别为9.0和35℃，pI为5.6[Menhard B,ZenkMH.Purification and characterization of acetyl coenzyme A:10-hydroxytaxane O-acetyltransferase from cell suspension cultures of Taxuschinensis.Phytochemistry,1999,50:763-774]。该细胞系在优化条件下可产生高达150mg/L云南紫杉烷C(taxuyunnanine C，该化合物不含四元氧环)，以该化合物为原料水解制备出一系列去乙酰化的化合物(10-deacetyltaxuyunnanine C,10,14-deacetyltaxuyunnanine C,5,10,14-deacetyltaxuyunnanine C,2,10,14-deacetyltaxuyunnanine C,2,5,10,14-deacetyltaxuyunnanine C)。催化实验证明该酶均能将这些化合物的C10位羟基乙酰化，但不能在其他位置上乙酰化，说明该酶具有区域选择性。还发现该酶也能将10-DAB的C10位羟基乙酰化，但对10表-10-DAB(10-epi-10-DAB)则不起作用，表现为立体选择性[Menhard B,Zenk MH.Purification and characterizationof acetyl coenzyme A:10-hydroxytaxane O-acetyltransferase from cellsuspension cultures of Taxus chinensis.Phytochemistry,1999,50:763-774]。