[发明专利]一种制备4-雄烯二酮的方法

说明书

本发明提供了一种4‑雄烯二酮的制备方法，所述方法包括：1)菌种繁殖，所述菌种为Mycobacterium sp.NRRLB‑3805；2)将底物植物甾醇与植物油、乳化剂混合后100‑120℃乳化，并将乳化后的溶液与适量的水、培养基混合后灭菌得到发酵培养基；3)将步骤1)繁殖后的菌种接入到步骤2)得到的发酵培养基中进行发酵培养；4)由经过步骤3)发酵的培养基中提取4‑雄烯二酮。本发明的方法提高了发酵过程中底物的投料量，推动了反应进程，使发酵的收率得到提高。

技术领域

本发明涉及甾体药物的微生物转化技术领域，特别涉及一种发酵降解植物甾醇制备4-雄烯二酮的方法。

背景技术

雄烯二酮是合成甾类激素药物重要的原料和中间体，4-雄烯二酮传统的生产工艺是从黄姜等植物中提取薯蓣皂苷，再经化学合成制备4-雄烯二酮；另一种是利用微生物转化植物甾醇生产4-雄烯二酮。前者废水排放量大，黄姜种植不稳定，国家管控越来越严格；后者操作简单、污染较小，为现阶段研究的热点。但是后者也存在一定的缺点，比如一般发酵过程为油水两相发酵，过程投料量低，蒸汽、水、电、人工等消耗大，收率相对于理论值偏低、后提取工艺存在溶剂使用较多等问题。在申请号为201310490547的中国专利申请中公开了雄烯二酮生产配方的优化，在申请号为201410113381的中国专利申请中公开了一种单水相系统发酵降解植物甾醇制备4-雄烯二酮的方法，在申请号为201310181803的专利申请中公开了一种用于制备雄烯二酮的微生物菌株及其应用，上述方法虽然均对雄烯二酮的制备方法，特别是发酵方法提出了优化设计，但是，上述专利中都存在底物甾醇投料量低的缺点，这样在无形中增加了废水处理的成本，同时发酵罐的利用率低，增加产品成本。虽然使用乳化剂可以代替植物油，但是当底物投料量大于3％时底物剩余量就会大大增加，所以如何提高底物投料量同时提高发酵收率是一个关键性技术难题。

发明内容

基于上述背景技术，本发明提供了一种高底物浓度的4-雄烯二酮的发酵方法，通过添加乳化剂和植物油，使底物植物甾醇的投料量由原来的4％提高到现在的8％，有效的节约了发酵成本，提高了发酵收率，减少了废水的排放。

一种4-雄烯二酮的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

1)菌种繁殖，所述菌种为Mycobacterium sp.NRRLB-3805；

2)将底物植物甾醇与植物油、乳化剂在发酵罐中混合后升温到100-120℃乳化，并将乳化后的溶液与水、培养基混合后灭菌得到发酵培养基；优选地，在所述植物甾醇、植物油和乳化剂三者中植物甾醇16-20重量份，植物油16-20重量份，乳化剂0.8-1.6重量份；更优选地，在所述植物甾醇、植物油和乳化剂三者中植物甾醇20重量份，植物油16重量份，乳化剂1重量份；

3)将步骤1)繁殖后的菌种接入到步骤2)得到的发酵培养基中进行发酵培养；

4)由经过步骤3)发酵的培养基中提取4-雄烯二酮。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)所述的菌种繁殖是通过包括下述步骤的方法实现的：

a)一级种子罐培养，培养40小时使一级种子罐中的菌种浓度达到5g每100ml发酵液以上；所述一级种子罐的培养基配方为：葡萄糖6-10g/L，甘油6-10g/L，硝酸钠4-6g/L，磷酸氢二铵0.4-0.8g/L，以去离子水定容至所需体积并调节pH值至7.5；

b)将步骤a)培养的菌种以10-20％的接种量接种到二级种子罐中，培养30小时，至二级种子罐中的菌种浓度达到10％以上；所述二级种子罐的培养基配方为：葡萄糖6-10g/L，甘油6-10g/L，硝酸钠4-6g/L，磷酸氢二铵0.4-0.8g/L，以去离子水定容至所需体积并调节pH值至7.5。