[发明专利]检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的RT‑PCR及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及PCR检测技术领域，特别是涉及用于检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的靶序列、RT-PCR引物，本发明还涉及利用该靶序列进行水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒检测的方法和试剂盒。

背景技术

玉米粗缩病(Maize rough dwarf disease,MRDD)是危害玉米生产的世界性病毒病害之一，在我国玉米产区发生严重。2008年到2013年，玉米粗缩病导致产量严重损失，普遍达到30％至50％，严重地区可达80％以上，甚至绝收。

玉米粗缩病病源主要有四种，均属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)。在欧洲，病源是玉米粗缩病毒(Maize rough dwarf virus,MRDV)；南美洲病源是马德里约柯托病毒(Mal de Rí o Cuarto Virus,MRCV)；在亚洲导致玉米粗缩病的病源是水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)或南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV),我国黄淮海地区主要病源是RBSDV，广东、海南以及越南和日本等地区的病源主要是SRBSDV。以上病毒同时也是水稻黑条矮缩病(Rice black-streaked dwarf disease,RBSDD)和小麦绿矮病(Wheat green dwarf disease,WGDD)等病害的主要病源。

玉米粗缩病病源RBSDV、MRDV和MRCV均是以灰飞虱(Laodelphax striatellus,SBPH)为传播介体以持久性传播；而近期发现的SRBSDV是以白背飞虱(Sogatella furcifera,WBPH)为介体持久性传播。四种病毒在寄主范围、血清学关系、病毒粒子结构、介体传毒方式及植物寄主发病方式等方面均较为相似，但通过基因序列比对确定其为两种不同病毒。

RBSDV完整病毒粒子为等轴的20面球体，直径约为70-80nm，其基因组由10条线性双链RNA(dsRNA)组成，10条双链dsRNA按在PAGE电泳中迁移率由慢到快分别命名为S1-S10，大小从4.5kb到1.8kb。目前研究表明，基因组共有13个开放阅读框(open reading frame,ORF)，S5、S7和S9区段分别含有两个ORF，其中S5区段的两个ORF部分重叠，其余7条基因组区段均只有一个ORF。

目前，常用的检测植物病毒的方法主要包含：分子方法检测，电镜观察，血清学检测以及生物学接种试验等。但以上检测方法很难准确鉴定病原，且操作方法相对复杂。

为了提高水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒检测的准确性和便捷性，有必要建立灵敏度更好、特异性更好的检测方法来鉴定RBSDV和SRBSDV。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的特异、灵敏、快速、简便的方法及其应用。

为实现上述目的，本发明通过对多年多点水稻黑条矮缩病毒基因核苷酸区段进行测序和比对，确定了保守区S5区段序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，该靶序列是检测水稻黑条矮缩病毒的遗传标记物。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性区段也可以作为检测水稻黑条矮缩病毒的遗传标记物。同时，在此区段内筛选到水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒一致性最低的序列。本发明根据该保守序列，通过反复对比、筛选，设计了用于检测并区分水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒遗传标志物的特异性引物对。

在本发明的一个实施方式中，优选的RBSDV特异性引物对的序列为：

RS5-F：ACGATCTTCTCGACCAAACC(SEQ ID NO.1)(RBSDVS5中位置：2436-2455)

RS5-R：AGCAAGAGTTGAAACACAACCG(SEQ ID NO.2)(RBSDV S5中位置：2834-2855)

优选的SRBSDV特异性引物对的序列为：

SS5-F：ACGATCTTCTCGACCAAACC(SEQ ID NO.3)(SRBSDVS5中位置：2439-2458)

SS5-R：AGCTTATCATCGCGCTGTAGT(SEQ ID NO.4)(SRBSDV S5中位置：2821-2841)