[发明专利]一种基于测定p38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法

权利要求书

1.一种基于测定p38MAPK蛋白磷酸化水平表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）蛋白样品提取制备：取斑马鱼脑部组织，加入细胞裂解液取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀，用Bradford蛋白分析法测定蛋白浓度；

（2）SDS凝胶电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE，所述SDS凝胶电泳中分离胶的质量分数为10%，浓缩胶的质量分数为5%，电泳过程处理温度为10℃；

（3）转膜：将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，转膜过程中保持温度为4℃；

（4）封闭：放入5%的脱脂奶粉中封闭1h，封闭过程中保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态；

（5）一抗、二抗孵育：用5%的脱脂奶粉稀释一抗，将已封闭的膜放入一抗稀释溶液中，4℃孵育盒中过夜，次日从冰箱里拿出来室温孵育1h；然后将膜再放入TBST中清洗3次，每次15min；期间用5%的脱脂奶粉稀释二抗，清洗好的膜放入二抗中孵育2h，然后用TBST洗膜3次，每次15min；

（6）显色反应：化学发光剂检测NC膜上目的蛋白，然后于暗室中用膜对X光片曝光，进行扫描，记录实验结果；

（7）计算结果：通过步骤（6）得出的实验结果计算斑马鱼M3受体变化；

所述一抗为针对p38MAPK的兔抗磷酸化p38MAPK抗体；

所述二抗为针对p38MAPK的HRP标记的羊抗兔IgG。

2.权利要求1所述方法在水质实时在线评估与监测中的应用。