[发明专利]一种基于测定p38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于生理生态学技术领域，具体涉及一种基于蛋白质免疫印迹技术检测斑马鱼M3受体蛋白的方法。

背景技术

近年来，随着经济的快速发展，水污染问题日益突出，严重影响生态环境的平衡和稳定。斑马鱼是一种小型热带淡水鱼，近年来，众多研究显示斑马鱼应用于环境毒理学研究中有其独特的优势，斑马鱼已逐渐成为环境毒理学家们的新宠，利用斑马鱼对水环境污染物进行快速监测已成为目前研究的热点。

目前，人们通常依据对斑马鱼死亡率、畸形率、体长、体重、躯体质量指数(BMI)等进行测定，然而斑马鱼的生物的病理损伤或死亡往往较为滞后，难以发挥快速监测的作用。近年来，有越来越多的研究指出鱼类对污染物的适应反应从神经内分泌活动变化开始，而M3受体(毒蕈碱型受体亚型之一)作为神经递质乙酰胆碱的受体，其蛋白含量变化必然受到污染物的影响。因此，对斑马鱼M3受体蛋白活性的测定可实现对水环境污染物的快速监测。

然而，目前对M3受体蛋白活性的测定主要集中在大鼠、小鼠、电鳐这些物种上，方法主要是放射结合分析法、蛋白质免疫印迹技术(Western Blotting)、ELISA等，其中，Western Blotting是检测蛋白质特性、表达和分布的一种最常用、成熟的方法，该方法不仅可以从蛋白质混合物中检出目标蛋白质，可以定性或半定量的确定细胞或组织中蛋白质的表达情况。由于该方法中必须使用与目的蛋白特异性结合的抗体，而目前尚未有用于检测斑马鱼M3受体的抗体，而且由于M3受体蛋白在组织和种属之间存在巨大差异性，市售的其他M3受体抗体如人M3受体抗体、小鼠M3受体抗体等与斑马鱼M3受体结合性极差，这使得蛋白质免疫印迹技术不能应用于斑马鱼M3受体的检测。

发明内容

针对上述现有技术的不足，发明人通过研究发现，p38MAPK信号转导通路主要参与细胞外应激引起的细胞内多种蛋白激酶的连锁反应，进而影响RNA转录和蛋白合成以及细胞表面受体表达等生物学功能，其中，磷酸化作为一个信号转导的分子开关，在不同通路，如代谢、神经信号转导、细胞分裂等方面控制着蛋白活性，而当受到污染物污染时，p38MAPK蛋白表达(磷酸化)发生变化以调节信号通路尤其是神经信号通路，以此可通过p38MAPK蛋白表达水平变化即可测定斑马鱼在不同污染物的不同浓度暴露下M3受体的变化。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

p38MAPK蛋白表达在检测斑马鱼M3受体蛋白中的应用。

一种基于测定p38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)斑马鱼脑部组织蛋白样品的制备；(2)SDS凝胶电泳；(3)转膜；(4)封闭；(5)一抗、二抗孵育；(6)显色反应；(7)计算M3受体变化结果。

优选的，所述SDS凝胶电泳中分离胶的质量分数为10％，浓缩胶的质量分数为5％；

优选的，所述封闭的具体步骤为：将步骤(3)中转好的膜置于5％的脱脂奶粉中，封闭时间为1h；

优选的，所述一抗为针对p38MAPK受体的兔抗P38/磷酸化P38抗体；

优选的，所述二抗为针对p38MAPK受体的HRP标记的羊抗兔IgG；

进一步优选的，所述一抗、二抗的稀释溶液均为5％的脱脂奶粉；

具体的，一种基于测定p38MAPK蛋白表达以检测斑马鱼M3受体蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)蛋白样品提取制备：取斑马鱼脑部组织，加入细胞裂解液取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀，用Bradford蛋白分析法测定蛋白浓度；

(2)SDS凝胶电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE，所述SDS凝胶电泳中分离胶的质量分数为10％，浓缩胶的质量分数为5％，电泳过程处理温度为10℃；

(3)转膜：将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，转膜过程中保持温度为4℃；

(4)封闭：放入5％的脱脂奶粉中封闭1h，封闭过程中保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态；

(5)一抗、二抗孵育：用5％的脱脂奶粉稀释一抗，将已封闭的膜放入一抗稀释溶液中，4℃孵育盒中过夜培养，次日从冰箱里拿出来室温孵育1h；然后将膜再放入TBST中清洗3次，每次15min；期间用5％的脱脂奶粉稀释二抗，清洗好的膜放入二抗中孵育2h，然后用TBST洗膜3次，每次15min。

(6)显色反应：化学发光剂(ECL)检测NC膜上目的蛋白，然后于暗室中用膜对X光片曝光，进行扫描，记录实验结果。