[发明专利]卡介菌多糖核酸在促进CIK细胞增殖和提高CIK细胞的杀瘤活性中的应用

权利要求书

1.卡介菌多糖核酸在促进CIK细胞增殖和增强CIK细胞杀瘤活性中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于卡介菌多糖核酸在制备肿瘤生物治疗细胞中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CIK细胞的制备步骤如下：

(1)人外周血单核细胞(PBMC)分离

①采集健康自愿者血液20mL，平衡温度至室温。同时将淋巴细胞分离液、生理盐水、培养基复温至室温；

②样品稀释：取一新的50mL离心管，先加入复温后的生理盐水10mL充分润洗管壁，然后用10mL移液管将血样转移至润洗过的50mL离心管，加生理盐水稀释血样至30mL，用移液管充分吹打均匀；

③梯度离心：取另一50ml离心管加入15mL人血淋巴细胞分离液，用10mL移液管将稀释血样缓缓转移至分离液上方，形成上下两相。22℃，390g离心30min(加速1，刹车0)；

④收集血浆：离心完成后，离心管内液相分为三层，从下往上分别为分离液、白膜层、血浆层，尽可能收集上层血浆至新的离心管，做好标记，-80℃冻存备用；

⑤收集白膜层：用10mL移液管或1mL移液器小心收集中间的白膜层至新50mL离心管；

⑥清洗Ⅰ：于收集了白膜层的离心管中加RPMI-1640至45mL，混匀，22℃，1000g离心10min(加速9，刹车9)，弃去上清液，加RPMI-1640至45mL重悬，吹打混匀；

⑦清洗Ⅱ：22℃，400g离心10min(加速9，刹车9)，弃去上清液，加RPMI-1640至45mL重悬，吹打混匀，取20μL细胞悬液进行台盼蓝染色计数，参照《细胞计数SOP》；

⑧清洗Ⅲ：22℃，201g离心10min(加速9，刹车9)，弃去上清液，按细胞数5×106个/mL加GT-T551培养液重悬，吹打混匀；

(2)PBMC诱导培养成CIK

转移GT-T551培养液重悬的细胞至T25细胞培养瓶，加入终浓度为500ng/mL CD3mAB及1000U/mL IL-2的细胞因子及10％FBS，置于37℃、5％CO2、90％相对湿度的细胞培养箱培养，隔天观察CIK细胞状态，若细胞培养基颜色发黄，适当补液，每3天进行细胞计数，按1.5-2.0×106/mL的细胞密度补加CIK培养液或半量换液。