[发明专利]卡介菌多糖核酸在促进CIK细胞增殖和提高CIK细胞的杀瘤活性中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药和生物治疗领域，具体涉及卡介菌多糖核酸提取物促进CIK细胞增殖和增强CIK细胞杀瘤活性中的应用，以及在制备CIK细胞中的应用。

背景技术

恶性肿瘤严重危害人类健康，目前常规的手术和放化疗治疗方法均不能彻底清除体内的瘤细胞，过继免疫治疗法因具有符合生理、低毒和高效等优点成为重要的肿瘤辅助治疗手段。其中，细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells。CIK细胞)是近年来发现的一种新型抗瘤细胞，是以CD3⁺CD56⁺T细胞为主的异质细胞群，兼有NK细胞和T细胞的特征。在功能上，CIK一方面拥有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，另一方面还拥有NK细胞非MHC限制性的杀伤肿瘤的特点，其增殖迅速、对正常造血影响轻微。CIK细胞的增殖和细胞毒活性依赖于多种外源性细胞因子的刺激，但何种因子组合为最佳尚无定论，因此研究如何进一步提高CIK的增殖和杀瘤活性已经成为抗肿瘤的过继免疫细胞生物治疗的一个热点。

发明内容

本发明的目的提供卡介菌多糖核酸在促进CIK细胞增殖和提高CIK细胞的杀瘤活性中的应用，技术方案如下：

卡介菌多糖核酸在促进CIK细胞增殖和增强CIK细胞杀瘤活性中的应用。

卡介菌多糖核酸在制备肿瘤生物治疗细胞中的应用，所述肿瘤生物治疗细胞为CIK细胞。

制备CIK细胞的步骤如下：

(1)人外周血单核细胞(PBMC)分离

①采集健康自愿者血液20mL，平衡温度至室温。同时将淋巴细胞分离液、生理盐水、培养基复温至室温。

②样品稀释：取一新的50mL离心管，先加入复温后的生理盐水10mL充分润洗管壁，然后用10mL移液管将血样转移至润洗过的50mL离心管，加生理盐水稀释血样至30mL，用移液管充分吹打均匀。

③梯度离心：取另一50ml离心管加入15mL人血淋巴细胞分离液，用10mL移液管将稀释血样缓缓转移至分离液上方，形成上下两相。22℃，390g离心30min(加速1，刹车0)。

④收集血浆：离心完成后，离心管内液相分为三层，从下往上分别为分离液、白膜层、血浆层，尽可能收集上层血浆至新的离心管，做好标记，-80度冻存备用。

⑤收集白膜层：用10mL移液管或1mL移液器小心收集中间的白膜层至新50mL离心管。

⑥清洗Ⅰ：于收集了白膜层的离心管中加RPMI-1640至45mL，混匀，22℃，1000g离心10min(加速9，刹车9)。弃去上清液，加RPMI-1640至45mL重悬，吹打混匀。

⑦清洗Ⅱ：22℃，400g离心10min(加速9，刹车9)，弃去上清液，加RPMI-1640至45mL重悬，吹打混匀，取20μL细胞悬液进行台盼蓝染色计数，参照《细胞计数SOP》。

⑧清洗Ⅲ：22℃，201g离心10min(加速9，刹车9)。弃去上清液，按细胞数5×10⁶个/mL加GT-T551培养液重悬，吹打混匀。

(2)PBMC诱导培养成CIK

转移GT-T551培养液重悬的细胞至T25细胞培养瓶，加入终浓度为500ng/mL CD3mAB及1000U/mL IL-2的细胞因子及10％FBS，置于37℃、5％CO2、90％相对湿度的细胞培养箱培养。隔天观察CIK细胞状态，若细胞培养基颜色发黄，适当补液。每3天进行细胞计数，按1.5-2.0×106/mL的细胞密度补加CIK培养液或半量换液。

本发明的有益效果：

(1)本发明中卡介菌多糖核酸促进CIK细胞增殖，增加相关细胞毒活性因子Granzyme B、Perforin、TNF-α、TNF-β、INF-γ、Fas的表达，提高CIK细胞的杀瘤效果；

(2)通过卡介菌多糖核酸诱导培养的CIK细胞能用于肿瘤疾病的细胞治疗。

附图说明

图1：BCG-PSN影响CIK细胞增殖的量效曲线

图2：CIK细胞杀伤效率统计图。

图3：CIK细胞RNA电泳图。其中Mark为DNA standard marker；1为对照组CIK细胞RNA；2为BCG-PSN实验组CIK细胞RNA。

图4：RT-qPCR检测CIK细胞毒活性相关因子表达。

具体实施方式：