[发明专利]测序文库构建中5’和3’接头连接副产物的去除方法

权利要求书

1.一种切割RNA-DNA：cDNA杂交双链体的方法，其特征在于，所述方法包括混合Cas酶、sgRNA和所述RNA-DNA：cDNA杂交双链体的步骤；其中，该杂交双链体中的DNA部分包含该Cas酶识别的前间区序列邻近基序(PAM)；该sgRNA能特异性结合该cDNA链的一部分；和该Cas酶能特异性识别该sgRNA，并切割所述杂交双链体；所述RNA为RNA测序文库构建过程中使用的5’接头，所述DNA为RNA测序文库构建过程中使用的3’接头；所述Cas酶是Cas9酶；所述sgRNA序列的靶标区与PAM序列紧邻，

其中，所述PAM序列的第1个碱基为所述DNA紧邻所述RNA的第1个碱基，所述sgRNA的靶标区由所述RNA靠近所述DNA一侧的15～25个碱基组成；或者，所述PAM序列的第1个碱基为所述DNA靠近所述RNA一侧的第m个碱基，m≥2，所述sgRNA的靶标区由跨所述RNA和所述DNA的片段组成。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA-DNA：cDNA杂交双链体产生于RNA测序文库的构建过程中。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgRNA序列由靶标区和Cas识别区组成，其中，靶标区的碱基序列由所述RNA-DNA序列上长15～25个碱基的片段组成，该片段紧邻该PAM序列的第1个碱基。

4.一种去除RNA测序文库构建时产生的5’和3’接头连接副产物的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）使用3’接头和5’接头与待测序RNA进行连接反应，获得连接反应的产物；

（2）对步骤（1）获得的产物进行反转录，获得反转录产物；和

（3）使步骤（2）获得的反转录产物与Cas酶和sgRNA混合，从而除去反转录产物中5’和3’接头连接副产物；

其中，所述3’接头含有所述Cas酶所识别的PAM序列；所述sgRNA能特异性结合反转录产生的cDNA链的一部分；和所述Cas酶能特异性识别所述sgRNA，并切割所述5’和3’接头连接副产物；所述Cas酶是Cas9酶；所述sgRNA序列的靶标区与PAM序列紧邻，

其中，所述PAM序列的第1个碱基为所述3’接头紧邻所述5’接头的第1个碱基，所述sgRNA的靶标区由所述5’接头靠近3’接头一侧的15～25个碱基组成；或者，所述PAM序列的第1个碱基为所述3’接头靠近5’接头一侧的第m个碱基，m≥2，所述sgRNA的靶标区由跨所述5’接头和所述3’接头的片段组成。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述sgRNA序列由靶标区和Cas识别区组成，其中，靶标区的碱基序列由所述5’和3’接头连接副产物上长15～25个碱基的片段组成，该片段紧邻该PAM序列的第1个碱基。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述Cas9酶选自化脓链球菌的Cas9、金黄色葡萄球菌的Cas9，以及嗜热链球菌的Cas9。

7.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）包括：

（1a）混合3’接头与待测RNA序列，进行3’接头连接反应；

（1b）加入3’接头的互补序列，退火，使互补序列与3’接头结合，并使步骤（1a）使用的连接酶变性失活；

（1c）混合5’接头与步骤（1b）获得的反应产物，进行5’接头连接反应；

从而获得含有5’和3’接头连接副产物和5’接头-RNA-3’接头的连接反应产物。