[发明专利]测序文库构建中5’和3’接头连接副产物的去除方法

说明书

本发明涉及测序文库构建中5’和3’接头连接副产物的去除方法。具体而言，本发明提供一种切割RNA‑DNA：cDNA杂交双链体的方法，所述方法包括混合Cas酶、sgRNA和所述RNA‑DNA：cDNA杂交双链体的步骤；其中，该杂交双链体中的DNA部分包含该Cas酶识别的前间区序列邻近基序(PAM序列)；该sgRNA能特异性结合该cDNA链的一部分；和该Cas酶能特异性识别该sgRNA，并切割所述杂交双链体；任选地，所述RNA‑DNA：cDNA杂交双链体产生于RNA测序文库的构建过程中；以及任选地，所述RNA为RNA测序文库构建过程中使用的5’接头，所述DNA为RNA测序文库构建过程中使用的3’接头。

技术领域

本发明属于核酸测序领域，尤其是基于接头连接的RNA测序，具体涉及测序文库构建中5’和3’接头连接副产物的去除方法。

背景技术

RNA深度测序(deep sequencing)的cDNA文库构建方法主要包括随机引物或oligo-dT引物反转录法和两步接头连接反转录法〔Reuter,J.A.，D.V.Spacek和M.P.Snyder，High-Throughput Sequencing Technologies，Molecular Cell，2015，58(4):p.586-597〕。前者通常用于mRNA等长转录本RNA的建库，而后者的应用更为广泛，适用于包括打断的长转录本RNA在内的任何适合连接反应的RNA深度测序文库的构建，例如小RNA测序〔Munafo,D.B.和G.B.Robb，Optimization of enzymatic reaction conditions forgenerating representative pools of cDNA from small RNA，RNA，2010，16(12):p.2537-52〕、CLIP测序〔Licatalosi,D.D.等，HITS-CLIP yields genome-wide insightsinto brain alternative RNA processing，Nature，2008，456(7221):p.464-469〕、RIP测序〔Helwak,A.等，Mapping the Human miRNA Interactome by CLASH Reveals FrequentNoncanonical Binding，Cell，2013，153(3):p.654-665〕、GRO测序〔Core,L.J.，J.J.Waterfall和J.T.Lis，Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing anddivergent initiation at human promoters，Science，2008，322(5909):p.1845-8〕等。

动植物细胞中普遍存在大量非编码小RNA(small non-coding RNA，ncRNA)。虽然小RNA的发生机制各不相同，但它们几乎参与所有生理及病理的基因表达调控过程，展现尤为丰富的表达类型，和高度的组织特异性。基于这类具有调控作用的功能分子的发现，近些年已有一些研究成功地将小RNA的谱系作为特定疾病诊断的标志物。未来小RNA的检测将会在疾病的早期诊断，分型和个体化检测治疗中得到广泛地应用。常用的小RNA定量检测技术包括深度测序技术、芯片技术(microArray)和qRT-PCR技术。后两者需要合成特异性探针，因此只能检测已知种类的小RNA。而深度测序技术，不仅可以从头发现一些新的小RNA序列，而且可以准确地区分仅有微小差异的同源序列，因而在小RNA检测中有无可比拟的技术优势。