[发明专利]一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法

权利要求书

1.一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法，其特征在于：使用可化学断裂的交联剂对细胞或提取的蛋白质样品进行交联，将蛋白质样品进行酶解后，一部分酶解产物进行衍生化反应后进入质谱分析，通过软件分析质谱谱图可挑选出含交联肽段的谱图，同时获取交联肽段的m/z及发生交联的肽段的N端氨基酸信息；将另一部分酶解产物使用化学法断裂交联剂后，使用富集材料将肽段进行富集，将富集出的肽段洗脱后进入质谱分析，根据搜库结果可确定发生交联的肽段，从而建立肽段库；通过交联肽段质谱谱图中确定的发生交联肽段的N端氨基酸信息可在肽段库中找到候选肽段，结合交联肽段质谱谱图m/z和肽段特征离子可确定交联肽段序列，从而获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息；

具体包括：

（1）对于细胞样品，使用缓冲液冲洗去除培养液并使细胞悬浮；对于已提取出的蛋白样品，使用水或缓冲液配制成溶液；对于交联剂，使用水、缓冲液或有机溶剂配制成溶液；

（2）将交联剂溶液加入至细胞样品溶液或蛋白样品溶液中进行反应；

（3）对于细胞样品，离心弃去反应体系中的反应液，然后对细胞样品进行裂解，得交联蛋白样品；对于蛋白样品，向反应体系中加入反应终止液，或通过透析、滤膜或凝胶去除反应液，得交联蛋白样品；

（4）采用pH为1-6.5的酸性缓冲溶液或pH为7.5-14的碱性缓冲溶液配制的溶有离子液体、表面活性剂、去垢剂或有机溶剂的溶解液来溶解交联蛋白样品，加入还原剂，高温孵育，同时进行蛋白质样品的变性及还原；

（5）加入烷基化试剂对变性及还原后的蛋白质样品进行烷基化反应后，向蛋白质样品中加入蛋白酶溶液进行酶解，并将酶解产物分成两份进行除盐并冻干；

（6）取出步骤（5）中一份冻干的酶解产物，对肽段末端氨基进行衍生反应，对衍生物进行样品分级，除盐，冻干并重溶进行质谱分析；

（7）取出步骤（5）中另一份冻干的酶解产物，向内加入交联剂断裂剂溶液将酶解产物中的交联剂进行断裂；

（8）步骤（7）反应结束后，使用终止剂终止断裂反应，或通过透析、滤膜、凝胶中的一种或者二种以上方法去除交联剂断裂剂溶液；

（9）向步骤（8）的产物中加入带有能与交联剂断裂生成基团发生共价键合基团的富集材料，并反应；

（10）使用洗脱液洗去富集材料上非特异性吸附的肽段；

（11）使用溶液将富集材料上键合的肽段释放出来，除盐，冻干并重溶进行质谱分析和数据检索；

（12）由步骤（6）中得到的交联肽段的质谱谱图中挑选出含交联肽段的谱图，并通过谱图中的a1离子得到对应的N端氨基酸，由步骤（11）中得到的富集出的肽段的搜库结果可建立肽段库，通过交联肽段质谱谱图中确定的发生交联肽段的N端氨基酸信息可在肽段库中找到候选肽段，结合交联肽段质谱谱图m/z和肽段特征离子可确定交联肽段序列，从而获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的缓冲液为pH为7.1-10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上，且不含能与所用交联剂上反应基团反应的基团；

步骤（1）中所述的细胞样品，为胰酶消化或细胞刮消化得到的活细胞样品；步骤（1）中所述的蛋白样品，为单一蛋白样品或二种以上蛋白的混合蛋白样品，配制的蛋白质量与溶液的体积比为1 µg/mL-100 mg/mL；步骤（1）中所述的交联剂，为两侧含有与蛋白反应的基团，且连接臂上含有化学断裂基团的交联剂，配制的交联剂浓度为1 µM-1 M；

步骤（1）中所述的有机溶剂，为乙腈、有机醇类、有机酸类、二甲基甲酰胺(DMF）或二甲基亚砜 (DMSO) 中的一种或二种以上。

3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的交联剂，其两侧基团分别为下述任一反应基团的化学物：两侧具有与蛋白上氨基反应的活性基团的化学物；或为两侧具有与蛋白上巯基反应的活性基团的化学物；或为两侧具有与蛋白上羧基反应的活性基团的化学物；或为两侧具有与蛋白上糖链反应的活性基团的化学物；且其连接臂上的化学断裂基团，为经氧化断裂的邻二羟基基团；或为碱性/盐酸羟胺断裂的酯类基团。