[发明专利]一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法

说明书

本发明涉及用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法。使用两侧具有反应活性基团且具有可断裂基团的交联剂将细胞内蛋白质复合体进行交联并酶解，取一部分酶解产物进行衍生化反应后进入质谱分析；另一部分酶解产物使用化学法断裂交联剂后，使用富集材料将肽段进行富集，将富集出的肽段洗脱后进入质谱分析，根据搜库结果可确定发生交联的肽段，从而建立肽段库。通过交联肽段质谱谱图中确定的发生交联肽段的N端氨基酸信息可在肽段库中找到候选肽段，结合交联肽段质谱谱图m/z和肽段特征离子可确定交联肽段序列，从而获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息。该方法具有操作简便等优点并应用于蛋白质的结构分析及蛋白质复合体相互作用的分析。

技术领域

本发明涉及一种用于研究蛋白质结构或蛋白质相互作用的分析方法。

背景技术

蛋白质的空间结构信息以及蛋白质间的相互作用信息对于研究蛋白质的功能有重要意义。生物体中的蛋白质空间构象的变化及蛋白质间的相互作用，构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此，研究蛋白质的空间结构信息及蛋白质间相互作用的方式和程度，将有助于蛋白质功能的分析、疾病致病机理的阐明和治疗及新型药物的开发等众多难题的解决。然而，研究蛋白质结构与相互作用的传统技术，如核磁共振技术(NMR)、X射线晶体衍射技术等，对于蛋白质的纯度、结晶性和绝对量均有比较高的要求，限制了其广泛应用。

交联质谱技术是近十多年来发展起来的新技术，它利用化学交联剂将细胞内空间距离足够接近、可以与交联剂反应的两个氨基酸以共价键连接起来，然后利用基于质谱技术的蛋白质组学对交联产物进行分析。交联质谱技术在研究蛋白质结构和蛋白质相互作用上具有以下优势：a.同时进行多种蛋白质的结构和相互作用分析；b.通过交联剂的共价交联作用，可以固定原本不稳定的蛋白质相互作用，从而可以研究易解离、结构松散的蛋白质复合物；c.相对于NMR和X射线晶体衍射技术，交联质谱技术灵敏度高、对蛋白质性状要求低、需要样品绝对量小；d.可以进行体内交联，有助于研究体内蛋白质结构和相互作用；e.使用不同臂长、不同反应基团的交联剂可以得到丰富的蛋白质空间结构和相互作用信息。(Andrea Sinz.Mass Spectrom Rev.2006,25,663-682.)

然而，使用传统交联质谱技术对交联质谱鉴定要求很高。由于交联肽段搜索空间随肽段数据库规模平方级增长，大部分搜索引擎只能用于纯化样品或简单蛋白质复合物，新发展的搜索引擎也只能用于酵母或大肠杆菌等低等生物，在人体细胞等复杂生物样本的全蛋白质组水平难以实现。同时，基于数据库搜索方法的质谱谱图鉴定，在一定程度上会发生随机匹配，使鉴定结果中存在不正确的结果。此外，由于多肽交联鉴定问题相对二肽交联鉴定，数据库规模更大、谱图离子更多、样品复杂度更高，目前的研究方法难以得到多肽交联形式的相关结果。

本发明使用两侧具有反应活性基团且具有可断裂基团的交联剂将细胞内蛋白质复合体进行交联并酶解，取一部分酶解产物进行衍生化反应后进入质谱分析，通过软件分析质谱谱图可挑选出含交联肽段的谱图，同时获取交联肽段的m/z及发生交联的肽段的a1离子信息，即N端氨基酸信息；另一部分酶解产物使用化学法断裂交联剂后，使用富集材料将肽段进行富集，将富集出的肽段洗脱后进入质谱分析，根据搜库结果可确定发生交联的肽段，从而建立肽段库。通过交联肽段质谱谱图中确定的发生交联肽段的N端氨基酸信息可在肽段库中找到候选肽段，结合交联肽段质谱谱图m/z和肽段特征离子可确定交联肽段序列，从而获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息。该方法具有操作简便、高效、高通量、高可信度的优点并可应用于蛋白质的结构分析及蛋白质复合体相互作用结合位点的分析。

发明内容

为了克服传统交联质谱技术无法实现复杂生物样本的全蛋白质组交联信息分析，鉴定结果误匹配多及难以实现多肽交联鉴定等不足，本发明提供一种使用带有可断裂基团的交联剂将细胞内蛋白质复合体进行交联并酶解，一部分交联肽段进行衍生化反应；一部分交联肽段进行交联剂断裂及肽段富集反应。通过分析衍生化反应后的交联肽段及富集的肽段可确定交联肽段序列。该方法具有操作简便、高效、高通量、高可信度的优点并应用于蛋白质的结构分析及蛋白质复合体相互作用结合位点的分析。