[发明专利]TAL效应子介导的DNA修饰

权利要求书

1.一种编码序列特异性内切核酸酶的重组核酸表达载体，所述载体包括编码TAL效应子内切核酸酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括与编码核酸酶的核苷酸序列连接的编码序列特异性TAL效应子的核苷酸序列，其中编码所述TAL效应子的核苷酸序列可操作性连接至启动子序列，且其中所述序列特异性内切核酸酶包括：

(a) 第一TAL效应子内切核酸酶单体，其包含多个TAL效应子重复序列和FokI内切核酸酶结构域，其中所述第一TAL效应子内切核酸酶单体能够结合靶DNA的第一特定核苷酸序列；

(b) 第二TAL效应子内切核酸酶单体，其包含多个TAL效应子重复序列和FokI内切核酸酶结构域，其中所述第二TAL效应子内切核酸酶单体能够结合所述靶DNA的第二特定核苷酸序列；

其中，所述第一特定核苷酸序列和所述第二特定核苷酸序列不相同且被间隔区分开，且其中所述第一TAL效应子内切核酸酶单体和所述第二TAL效应子内切核酸酶单体能够形成二聚体，当所述第一TAL效应子内切核酸酶单体与所述第一特定核苷酸序列结合且所述第二TAL效应子内切核酸酶单体与所述第二特定核苷酸序列结合时，所述二聚体在活细胞中的所述靶DNA内产生双链断裂。

2.如权利要求1所述的重组核酸表达载体，其中所述序列特异性TAL效应子中的核苷酸序列编码许多串联重复，各串联重复在位置12和13处具有高度可变残基，所述串联重复能够识别并结合特异DNA序列。

3.如权利要求2所述的重组核酸表达载体，其中各所述重复是34个氨基酸的重复，并选自于如SEQ ID NO: 31所示的区域。

4.如权利要求1-3中任一项所述的重组核酸表达载体，其中所述序列特异性TAL效应子的核苷酸序列通过将合适的重复依序引入Gateway-ready高拷贝细菌克隆载体中来组装，所述载体包括tal基因的截短形式，其缺少中央重复区域，除了最后的特征性半重复。

5.如权利要求1-3中任一项所述的重组核酸表达载体，其中所述载体为质粒形式。

6.如权利要求4所述的重组核酸表达载体，其中所述载体为质粒形式。

7.生产序列特异性内切核酸酶mRNA或蛋白质的方法，包括使权利要求1-6中任一项所述的重组核酸表达载体转录或翻译的步骤。

8.权利要求7所述的方法获得的序列特异性内切核酸酶mRNA。

9.一种治疗组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的重组核酸表达载体或权利要求8所述的mRNA。

10.权利要求9所述的治疗组合物，其用于治疗病毒疾病。

11.一种在细胞中靶向遗传重组的方法，所述方法包括：

(a)将编码靶向所选DNA靶序列的TAL效应子内切核酸酶的权利要求1-6中任一项所述的重组核酸表达载体或权利要求8所述的mRNA引入分离的细胞；

(b)诱导所述TAL效应子内切核酸酶在细胞中表达；和

(c)鉴定所选DNA靶序列显示突变的细胞。

12.如权利要求11所述的方法，其中步骤c)中的所述突变选自下组：遗传物质的缺失、遗传物质的插入、或遗传物质的缺失和插入。

13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述细胞是昆虫细胞、植物细胞或鱼细胞。

14.如权利要求11或12所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。