[发明专利]TAL效应子介导的DNA修饰

说明书

本发明为TAL效应子介导的DNA修饰，本发明提供涉及基因靶向(例如，用转录激活因子样效应子核酸酶的基因靶向)的材料和方法。

相关申请的交叉参考

本申请要求2009年12月10日提交的美国临时申请序列号61/285,324、2010年6月7日提交的美国临时申请序列号61/352,108和2010年7月22日提交的美国临时申请序列号61/366,685的优先权，所有申请通过引用全文纳入本文。

有关联邦资助的研究的声明

本发明是在国家科学基金会(National Science Foundation)授予的基金号0820831和0504304下由政府资助完成。政府对本发明拥有某些权利。

技术领域

本发明涉及基因靶向的方法，尤其是包括使用转录激活因子样(TAL)效应子序列的方法。

背景技术

通过同源重组修饰染色体的能力(基因靶向)一直是生物学家的奋斗目标。例如，在植物中，基因靶向可有助于了解植物基因功能，为农作物改良提供新的可能。例如，利用基因靶向可进行重排代谢途径所需的遗传手术以产生高价值农作物，包括改变油或糖分布的种子、提高营养品质的食物或对疾病和压力抗性增加的植物。在动物(例如哺乳动物)中，基因靶向可用于治疗疾病。例如，基因靶向可用于对由各种形式突变引起的缺陷基因进行工程校正。这种基因靶向的有效方法难以实现。

发明内容

黄单胞菌属(Xanthomonas)中植物病原菌的TAL效应子通过结合宿主DNA和激活效应子特异的宿主基因，在疾病或引发防御中起重要作用(参见例如，Gu等(2005)Nature435:1122；Yang等(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:10503；Kay等(2007)Science 318:648；Sugio等(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:10720；和等(2007)Science318:645)。特异性取决于不完善的可变效应子数量，通常是34个氨基酸重复(Schornack等(2006)J.Plant Physiol.163:256)。多态性主要发生在重复位置12和13，本文将其称为重复可变双残基(RVD)。

本发明部分基于TAL效应子的RVD以直接、线性形式对应于其靶位置的核苷酸，一种RVD对应于一种核苷酸，有一些简并性且没有明显的环境依赖性。这个令人意外的发现代表蛋白-DNA识别的新机制，能针对新靶向特异性TAL效应子进行靶位置预测。如本文所述，这些蛋白可作为靶向的嵌合核酸酶用于研究和生物技术，有助于基因组工程改造中的同源重组(例如添加或提高用于植物中生物燃料或生物可再生物的特征)。这些蛋白还用作例如转录因子，且特别用于需要很高水平特异性的治疗应用，例如(非限制示例)针对病原体(如病毒)的治疗。

在一个方面，本发明涉及改良细胞遗传物质的方法，所述方法包括(a)提供含靶DNA序列的细胞；和(b)将转录激活因子样(TAL)效应子-DNA修饰酶导入所述细胞，所述TAL效应子-DNA修饰酶包括(i)修饰双链DNA的DNA修饰酶结构域，和(ii)TAL效应子结构域，包括联合结合靶DNA序列中特异性核苷酸序列的多种TAL效应子重复序列，从而所述TAL效应子-DNA修饰酶修饰细胞或其后代中所述特异性核苷酸序列内或相邻的靶DNA。本方法还可包括将含有与至少部分靶DNA序列同源的序列的核酸提供给细胞，从而在所述靶DNA序列和所述核酸之间产生同源重组。所述细胞可为真核细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或原核细胞。所述靶DNA可为染色体DNA。所述导入可包括用编码TAL效应子DNA修饰酶的载体转染细胞、将TAL效应子DNA修饰酶作为蛋白机械注射入细胞、用细菌III型分泌系统将TAL效应子DNA修饰酶作为蛋白递送到细胞，或通过电穿孔将TAL效应子DNA修饰酶作为蛋白导入细胞。所述DNA修饰酶可为内切核酸酶(如II型限制性内切酶如FokI)。