[发明专利]一种同时检测食品中氨基酸和生物胺的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学领域,具体涉及一种同时检测食品中氨基酸和生物胺的分析方法，尤其是涉及一种利用4’-碳酰氯-罗丹明作为衍生试剂，超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测的分析方法。

背景技术

氨基酸和生物胺是一类具有生物活性的低分子质量含氮有机化合物，广泛存在于各类食品中，例如：红酒，白酒，啤酒，肉制品，奶酪，水产品等。近年来的研究表明，生物胺的产生主要来源于微生物体内游离氨基酸的脱羧作用，摄入适量的氨基酸和生物胺对于维持人体正常的生理活动是必需的。如果食品中生物胺含量超标，会严重影响食品风味甚至改变其成分，而且对人体产生严重的毒害作用，造成人体神经系统和心血管系统损伤，因此，食品中氨基酸和生物胺的含量检测与监督引起了广泛关注。

但氨基酸和生物胺分子往往缺乏光谱、色谱或质谱灵敏检测的化学结构，并且在食品中的含量低、基质干扰严重，因此采用传统的紫外-可见光谱法、色谱法及质谱法检测的灵敏度都很低，难以准确定量。使用化学衍生手段，提高色谱-质谱检测灵敏度是一个很好的解决办法。中国专利（CN103837635A）公开了一种利用商品化丹磺酰氯作为衍生试剂，通过超高效液相色谱法对鱼露样品中的生物胺进行测定的分析方法，显著提高了生物胺的灵敏度。丹磺酰氯是测定生物胺中应用较多的衍生试剂，但是该衍生试剂存在衍生反应时间长，试剂本身及衍生产物易分解，生成干扰副产物等缺点；文献《RP-HPLC 柱后衍生法检测干酪中6 种生物胺》（中国食品学报，2015, 15(5): 213-218）使用邻苯二甲醛为衍生试剂，对干酪中的生物胺进行了定量检测，但邻苯二甲醛的衍生物不稳定需尽快检测，重复性差、衍生时间长等，且仅与初级胺反应，一定程度上限制了它的广泛使用。因此，开发一种衍生化反应条件温和、简单、快速、高灵敏且能同时测定食品中多种氨基酸和生物胺的分析方法，对于食品质量的监督和评价具有十分重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何快速、准确且高灵敏的同时检测食品中多种氨基酸和生物胺。本发明的目的是提供一种原位衍生技术，对氨基酸和生物胺同时衍生标记及检测分析方法。首次使用了4’-碳酰氯-罗丹明对氨基酸和生物胺的活性基团进行衍生化，同时利用溴苯替代了传统的、毒性的氯代溶剂作为萃取剂，解决了环境不友好的问题。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种同时检测食品中氨基酸和生物胺的分析方法，所述的氨基酸和生物胺在温和条件下与衍生试剂4’-碳酰氯-罗丹明发生原位衍生反应，得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。

上述分析方法具体包括以下步骤：

a. 超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取：取10-100 µL标准品混合溶液或预处理的待测样品，10-30 µL内标物溶液、500-800 µL pH 8.0-10.0的 NaHCO₃-Na₂CO₃缓冲溶液，加入离心管中，注入60-200 µL萃取剂和200-300 µL 4’-碳酰氯-罗丹明-分散剂溶液，摇匀后密封，在温度10-60 ºC水浴中超声波振荡反应1-5分钟；离心分离，所得沉积相取出后用乙腈定容到200 µL，得氨基酸和生物胺衍生物萃取物溶液；

b. 将氨基酸和生物胺衍生物萃取物溶液经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。

进一步的，所述待测样品为液体时采用的预处理方法为：将液体样品直接超声3 min后即可；所述待测样品为固体时采用的预处理方法为：将固体样品粉碎或匀浆后，每2 g固体样品中加入20 mL浓度为0.1 mol/L的盐酸，超声3 min后离心，取上清液即可。

进一步的，所述内标物溶液为1×10^-5 mol/L 的1,7-二氨基庚烷的乙腈溶液；所述萃取剂为1-溴-3-甲基丁烷，溴代环己烷，1-溴代辛烷或溴苯；所述的分散剂为丙酮，乙腈，甲醇或乙醇。

进一步的，所述萃取剂最优化的为溴苯；所述分散剂最优化的为乙腈。

进一步的，所述4’-碳酰氯-罗丹明-分散剂溶液的摩尔浓度为1×10^-2 mol/L。