[发明专利]一种产松柏醇的工程菌、构建方法及产松柏醇的用途

说明书

本发明公开了一种产松柏醇的工程菌、构建方法及产松柏醇的用途，构建方法：全化学合成TAL、COMT、4CL和CCR基因；PCR克隆hpaBC、yahK、metK和pntAB基因；全化学合成pBPE001、pBPE002、pBPE003；将基因TAL、hpaBC、COMT与pBPE001连接，得到pTHM；将基因4CL、CCR、yahK与pBPE002连接，得到pLRH；将基因pntAB、metK与pBPE003连接，得到pNAM；将T7RNA聚合酶基因整合到SyBE‑002447底盘菌株，得到SyBE‑002447(DE3)菌株；将pTHM、pLRH和pNAM转化到SyBE‑002447(DE3)，得到工程菌SyBE‑CNF。以葡萄糖为碳源，进行发酵生产松柏醇。本发明使用工程大肠杆菌生产松柏醇，可解决松柏醇的来源问题，降低成本。

技术领域

本发明所属生物医药技术领域，涉及一种产松柏醇的工程菌、构建方法及产松柏醇的用途。

背景技术

松柏醇(Coniferyl alcohol)，分子式是C₁₀H₁₂O₃，分子量为180.20，片状晶体，易溶于乙醚，溶于乙醇，不溶于水。松柏醇作为重要医药中间体，在医药上用作合成抗癌药物鬼臼毒素和抗肝炎药物水飞蓟宾的重要中间体。

目前对松柏醇的合成主要有以下三种方法。

(1)以乙酰阿魏酸为原料，制得酰氯后，再酯化，最后还原得到松柏醇，但其总收率仅24.4％；(2)以阿魏酸为原料，经酯化，乙酰化，再经还原得到松伯醇，总收率70.2％；这两种方法都需要用到氢化铝锂还原，收率欠佳，且操作不便；(3)以香草醛为原料，与丙二酸缩合后得到阿魏酸，经酯化和乙酰化后得乙酰阿魏酸乙酯，再用硼氢化锂还原后得到松伯醇，总收率可达73.6％，改进后的路线原料易得，反应条件温和，收率提高，成本降低，为松柏醇的大量制备提供了可能。

但是，上述有机合成原料与生产工艺存在环境污染，不符合绿色环保可持续发展的要求。近年来，随着合成生物技术的不断进步，使用工程微生物生产化学品逐渐成为备受关注的方法。但目前为止还没有任何文献报道利用工程微生物合成松柏醇。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供产松柏醇的工程菌。

本发明的第二个目的是提供产松柏醇的工程菌发酵制备松柏醇的方法。

本发明的第三个目的是提高工程菌产松柏醇产量的方法。

本发明的技术方案概述如下：

产松柏醇的工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)化学合成TAL、COMT、4CL和CCR基因，所述基因TAL、COMT、4CL和CCR的核苷酸序列依次用SEQ ID No.05，SEQ ID No.06，SEQ ID No.07，SEQ ID No.08所示；

(2)PCR克隆hpaBC、yahK、metK和pntAB基因；所述基因hpaBC、yahK、metK、pntAB的核苷酸序列依次用SEQ ID No.01，SEQ ID No.02，SEQ ID No.03，SEQ ID No.04所示；

(3)全化学合成以SEQ ID No.09所示的表达载体骨架pBPE001、以SEQ ID No.10所示的表达载体骨架pBPE002、以SEQ ID No.11所示的表达载体骨架pBPE003；

(4)将所述基因TAL、hpaBC、COMT与表达载体骨架pBPE001通过酶切连接方式进行连接，得到重组表达载体pTHM；将所述基因4CL、CCR、yahK与表达载体骨架pBPE002 通过酶切连接方式进行连接，得到重组表达载体pLRH；将所述基因pntAB、metK与表达载体骨架pBPE003通过酶切连接的方式进行连接，得到重组表达载体pNAM；