[发明专利]一种人α1‑抗胰蛋白酶的冻干组合物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物制品的保存方法,具体涉及一种人α1-抗胰蛋白酶的冻干保护剂及其制备方法。

背景技术

人α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1AT或AAT)，具有蛋白酶抑制作用的一种急性时相反应蛋白，分子量为53KDa，PI范围为4.7-5.0，血浆中含量约为2g/L,占蛋白质总量的3％-4％，是一种糖蛋白，含有10％-12％糖。在醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳中泳动于α1区带，是这一区带的主要组分。区带中的另2个主要组分；α1-酸性糖蛋白含糖量特别高，α1-脂蛋白含脂类特别高，因此蛋白质的染色都很浅。作为蛋白酶的抑制物，它不仅作用于胰蛋白酶，同时也作用于糜蛋白酶、尿激酶、肾素、胶原酶、弹性蛋白酶、纤溶酶和凝血酶等。AAT占血清中抑制蛋白酶活力的90％左右。正常人血浆参考值：(1)酶速率法(37℃):0.85-2.13U/L。(2)免疫比浊法:14.2-36.4μmol/L。AAT的抑制作用有明显的pH依赖性，最大活力处于中性和弱碱性，当pH4.5时活性基本丧失，这在最终冻干保护配方的筛选中具有重要意义。

AAT具有多种遗传分型，利用不同pH的缓冲剂和电泳支持物，迄今已分离鉴定有33种等位基因(allotypes)，其中最多见的是PiMM型(为M型蛋白抑制物的纯合子体)占人群的90％以上，另外还有两种蛋白称为Z型和S型，可表现为以下遗传分型：PiZZ、PiSS、PiSZ、PiMZ、PiMS，S型蛋白与M蛋白之间的氨基酸残基仅有一个差异。对蛋白酶的抑制作用主要限于血循环中M型蛋白的浓度。以MM型的蛋白酶抑制能力为100％相比，ZZ型的相对活力仅为15％、SS为60％、MZ为57％、MS为80％，其它则无活性。

血源性AAT的制备，主要从血浆或低温乙醇的组分Ⅳ沉淀开始，经过复溶、PEG沉淀、层析等分离纯化步骤制得冻干制品。其中层析所用介质包括DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析Sephacryl S-200分子筛等

人α1-抗胰蛋白酶的病毒灭活方法主要采用巴氏法和纳米膜过滤法。发明人对人α1-抗胰蛋白酶的巴氏法灭活病毒效果进行研究，结果显示巴氏法可有效灭活人α1-抗胰蛋白酶中的指示病毒，效果良好。

人α1-抗胰蛋白酶的适用症：安娜·加西亚·昆塔娜(中国专利CN201010216841.8)发现人α1-抗胰蛋白酶可用于治疗慢性疲劳综合征(CFS)；尹格内乔·布兰科·布兰科(中国专利CN200510093746.2)发现人α1-抗胰蛋白酶15-360mg/kg/周，2-3次输注后，在治疗纤维肌痛中效果显著。H.M.米徳和P.R.波尔登(中国专利CN201280070084.5)发现重组人α1-抗胰蛋白酶在炎症性疾病中有良好应用。此外，人α1-抗胰蛋白酶在人α1-抗胰蛋白酶原发性缺陷性疾病和慢性阻塞性肺部疾病。

α1-抗胰蛋白酶在完整的分子模型中，活性中心的氨基酸序列Met358-Ser359，位于由6股丝状结构折叠形成的A片层结构(β片层)的末端，也是椭圆形分子的末端。α1-AT由于活性中心的特点，通常存在三种形式：天然、酶切及惰性。稳定性由弱到强：天然，惰性，酶切。天然的α1-AT在加热到60度以上时会形成多聚体(polymers)，在90度－100度时会形成聚合体(aggregates)，酶切后的α1-AT在100度加热2小时后仍然稳定，惰性的α1-AT在70度以下稳定，80度以上便有多聚体产生，90－100度没有聚合体产生的现象。本制备最终为冻干剂型，干热过程中会导致α1-AT活性中心失活形成多聚体，本发明目的就是为了研发一种适合的保护剂可以防止多聚体的形成，同时也防止α1-AT采取失活、单体和惰性的形式存在(Preparation and characterization of latentα1-antitrypsin.The Journal of biological chemistry,Vol 270,No.10,Issue of March 10,pp.5282-5288,1995)。

欧洲已上市的产品PROLASTIN/ARALAST/ZEMAIRA等制得的α1抗胰蛋白酶最终保存方式是冻干。

杨莉等发明了一种规模化生产人α1-抗胰蛋白酶的方法，其中提到了巴氏灭活过程使用的配方为甘氨酸和葡萄糖。(中国专利CN 102180966 B)。

卜凤荣等在专利α1-抗胰蛋白酶的制备方法中提到了巴氏灭活的保护剂为蔗糖和柠檬酸钠。(中国专利CN 100562523C)