[发明专利]链格孢毒素链格孢酚单甲醚胶体金免疫层析试纸条

说明书

技术领域

本发明属于食品安全领域中涉及免疫胶体金试纸条和真菌毒素残留检测的领域。具体而言，本发明涉及一种适用于检测果蔬中链格孢毒素——链格孢酚单甲醚(AME)残留的胶体金免疫层析试纸条。

背景技术

链格孢霉菌属于丝状真菌，是一种普遍存在于水果、蔬菜等食品中的病原体和腐生菌，它可以在低温潮湿的环境下生长繁殖，因此是导致冷藏或长途运输过程中水果、蔬菜等食品腐烂变质的主要微生物。链格孢酚单甲醚(AME)是链格孢霉菌的主要次生代谢产物之一，由于它具有诱变性、基因毒性、致癌性，能够诱导单链DNA和双链DNA的断裂，并且还被鉴定为拓朴异构酶Ⅰ和Ⅱ强有力的抑制剂，摄取链格孢毒素侵染的食品会对人体健康造成严重危害。因此，AME成为目前国内外科学家研究较多的主要的链格孢毒素之一。

但到目前为止，国内外现行的食品中真菌毒素的限量标准尚不包括链格孢毒素，然而近年来，欧盟已经就食品与饲料中链格孢毒素对人畜的健康风险发布了科学意见，并且在国际贸易中，商家委托第三方检测链格孢毒素的现象已经十分普遍，其检测主要采用实验室中的气相色谱(GC)、气质联用(GC-MS)、液相色谱(LC)、液质联用(LC-MS)等传统检测方法。然而，这些传统的检测方法通常需要大型、昂贵的仪器设备以及专业的技术人员，并且检测只能在实验室中进行，检测时间长，费时费力，不能满足当前食品安全领域所追求的实时、快速、便携式检测的需求。

针对链格孢毒素AME传统检测方法的不足，我们设计了一种可用于检测水果、蔬菜等食品中链格孢毒素AME的胶体金免疫层析试纸方法，该方法具有快速、操作简单、高特异性、高灵敏性、检测成本低、不需要检测仪器，并且特别适用于现场大量样本的实时、快速抽样检测，能够更好地辅助我国食品企业及政府职能监管部门等开展相关的检测工作。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种采用一步法间接竞争免疫层析试纸条技术快速检测果蔬样本中链格孢毒素AME残留的胶体金试纸条，链格孢毒素AME的检测灵敏度可达10ng/mL。

为了实现本发明的发明目的，本发明提供了一种检测链格孢毒素链格孢酚单甲醚(AME)的免疫层析试纸条，包括样品垫、胶体金结合垫、NC膜、吸水垫和PVC底板，所述NC膜粘附在PVC底板上，胶体金结合垫和吸水垫分别粘附在NC膜的两端，样品垫粘附在胶体金结合垫的另一端；胶体金结合垫上包被有胶体金-AME单抗复合物。

进一步地，所述胶体金-AME单抗复合物的制备方法如下：用还原剂将氯金酸还原成胶体金纳米颗粒；将胶体金与AME单克隆抗体混合孵育30min，加入10％的BSA溶液使其终浓度为1％，反应20min后，加入10％的PEG20000并使其终浓度为0.2％，继续反应20min；离心纯化、浓缩产生胶体金-AME单抗复合物。所述还原剂优选柠檬酸三钠。

更进一步地，所述AME单克隆抗体的制备方法如下：

(1)AME羧基化衍生物半抗原制备：将10mg的AME，14.5mg溴丁酸甲酯和30.2mg的碳酸钾溶于1mL的甲酰胺(DMF)溶液，50℃磁力搅拌反应2h；待反应混合物冷却后，加入2mL水稀释，随后用酒精进行萃取得到沉淀中间产物(15mg)；将沉淀溶于0.5mL甲醇和0.5mL四氢呋喃(THF)混合液，随后加入到含有1.8mg氢氧化锂的水溶液(0.1mL)中，室温条件下反应5h，得到羧基化修饰的AME半抗原(40mg)；

(2)AME-BSA抗原制备：将15.8mg AME半抗原溶于1.5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；加入13.7mg二环己基碳二亚胺(DCC)，搅拌30min；加入7.6mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温避光磁力搅拌3.5h；离心，除去沉淀物N,N′-二环已基脲；将上清液逐滴加到由磷酸缓冲液(0.1M，pH 7.4)配制的BSA溶液中，室温避光搅拌2h；用0.1mol/L的PBS溶液透析3d，每天换液3次，即得AME-BSA抗原；分装后，保存于-20℃冰箱中备用；

(3)抗体筛选与纯化：