[发明专利]热稳定性提高的酸性淀粉酶突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及热稳定性提高的酸性淀粉酶突变体及其制备方法和应用。本发明的淀粉酶突变体相对于深海嗜热菌来源的淀粉酶成熟肽，第181位和第182位氨基酸缺失；并且，第363位突变为甘氨酸或第463位突变为苏氨酸。本发明的淀粉酶突变体不仅具有原始淀粉酶的耐酸能力，而且热稳定性大大提高。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，更具体地，本发明涉及热稳定性提高的酸性淀粉酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

淀粉是葡萄糖分子通过糖苷键连接而成的高聚物，分为两种类型，直链淀粉和支链淀粉。两种淀粉具有不同的结构和特性，直链淀粉是由多达6000个葡萄糖分子通过α-1,4-糖苷键连接，支链淀粉主链是由较短的含10～60葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接，侧链是通过β-1,6-糖苷键与主链连接，侧链长度一般为15-45个葡萄糖单元，通过α-1,4-糖苷键连接起来。

从催化专一性上看，把α-淀粉酶归为糖苷水解酶类(glycosyl hydrases)的第13家族，属于α-葡萄糖苷水解酶(α-Glycosyl hydrases，EC 3.2.1)，α-淀粉酶(α-amylase)又称为液化淀粉酶，其系统名称为α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(α-1,4-glucan-glucanhydrolase EC 3.2.1.1)，常用名α-淀粉酶，又名α-1,4糊精酶，是一种内切酶，能水解淀粉分子中的α-1,4糖苷键，将其任意切成长短不一的短链糊精和少量的低相对分子质量糖类，直链淀粉和支链淀粉均以无规则的形式进行分解，从而使淀粉糊的粘度迅速下降，即“液化”起作用，故α-淀粉酶又称为液化酶。

淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于淀粉转化、洗涤行业、燃料乙醇生产、食品工业、发酵、造纸、纺织品工业和医药行业等，占了整个酶制剂市场份额的30％。

α-淀粉酶根据最适反应pH值的不同，分为酸性淀粉酶、中性淀粉酶和碱性淀粉酶。酸性α-淀粉酶为来源于细菌、真菌的淀粉酶，其最适反应pH范围一般为酸性或中性，已广泛应用于食品、化妆品和医药等领域。

酸性α-淀粉酶在淀粉加工行业是应用最广泛的，在淀粉液化过程中发挥重要作用。工业上双酶法制糖已经取代了传统的酸法制糖，第一步用到的液化酶即α-淀粉酶至少需要耐受淀粉的糊化温度50-80℃，目前耐受高温的淀粉酶均来自细菌发酵生产，在中国广泛应用的淀粉酶主要有三种，即7658淀粉酶(BAA)、中温淀粉酶(BSA)和耐高温α-淀粉酶(BLA)，均来源于芽孢杆菌，这些酶的特性如表1。

表1、三种工业用α-淀粉酶

来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的α-淀粉酶(BStA)也是最早发现的具有良好性能的淀粉酶，在国外也被应用于淀粉加工，例如Genencor公司在我国销售的耐高温淀粉酶PRIME就是用未经基因改造的嗜热脂肪芽孢杆菌生产的。

目前制糖工艺广泛采用喷射液化，喷射温度一般在105～108℃，在中间高温维持罐停留5-6min，BLA能很好地适应该工艺要求。BLA是中国产量最大的淀粉酶，国外最大的酶制剂制造商Novozyme和Genecor销量最大的α-淀粉酶和SPEZYME PREDTM、GC262SPTM为其同类产品。

市场上应用的α-淀粉酶有一些缺陷，一般α-淀粉酶在pH 6.0以下失活，而淀粉浆的自然pH值为4.5，所以应用中需要加氢氧化钠调节pH至6.0进行催化反应，而且由于α-淀粉酶通常是Ca²⁺依赖的，所以需要添加Ca²⁺。因此制糖工艺不仅需要耐受高温的α-淀粉酶，还需要耐酸、Ca²⁺非依赖的α-淀粉酶。

鉴于目前耐高温的淀粉酶的需求量大，市售淀粉酶有一些缺陷，开发热稳定性好、耐酸的淀粉酶成了本领域的当务之急。

发明内容