[发明专利]一种分离测定唾液中有机酸和脂肪酸物质的方法

权利要求书

1.一种分离测定唾液中有机酸物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤（1），样品采集：将脱脂棉置于口腔内，放置0.2-5 min后，取出吸收了唾液的脱脂棉，置于注射器针筒中，利用注射器推杆推移挤压，挤出液收集于离心管中，经高速离心后，收集上清液得到唾液样品；

步骤（2），盐析萃取：移取唾液样品于离心管中，加入甲醇、氯化钠、萃取用盐和pH调节剂，经涡旋振荡至混合均匀后离心，取甲醇所在的萃取液层，得到第一萃取液；

甲醇加入量与唾液样品的体积比为0.5-2：1；氯化钠的加入质量为唾液样品质量的5-20%；

所述的萃取用盐为无水硫酸镁和无水硫酸钠中的一种或两种的组合物；萃取用盐的加入质量为唾液样品质量的40-70%；

pH调节剂为液体酸或缓冲盐，液体酸为盐酸、硫酸、甲酸和乙酸中的一种或多种的组合，缓冲盐为柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠中的一种或两种的组合；液体酸的加入体积是唾液样品体积的0.01-1%，缓冲盐的加入质量是唾液样品质量的10-25%；

步骤（3），甲酯化：将步骤（2）得到的第一萃取液中加入促甲酯化反应试剂后在50-80℃下的密闭条件进行甲酯化反应，反应完成后，加入饱和食盐水和萃取溶剂进行萃取，取萃取液层并用水洗至中性，加入干燥剂进行干燥，得到第二萃取液；

所述的促甲酯化反应试剂为硫酸、盐酸、氢氧化钾或三氟化硼，加入体积为步骤（2）得到的第一萃取液体积的5-40%；所述的饱和食盐水的体积是步骤（2）得到的第一萃取液体积的50-200%；

所述的萃取溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷或环己烷；每次萃取萃取溶剂的体积是步骤（2）得到的第一萃取液体积的25-100%；

所述的干燥剂为无水硫酸镁或无水硫酸钠；干燥剂的质量是步骤（2）中萃取溶剂质量的5-25%；

步骤（4），测定：将步骤（3）得到的第二萃取液，在30-45℃下浓缩至近干后，用正己烷复溶，正己烷的用量为步骤（2）移取唾液样品体积的10-200%；根据标准曲线计算有机酸物质的含量；

所用分析方法为气相色谱-质谱联用法，气相色谱条件如下：

色谱柱为长度×内径×膜厚为60 m×0.32 mm × 0.25 μm，DB-5MS石英毛细管柱；载气氦气，纯度≥99.999 %，恒流模式，流量2.5 mL/min；进样口温度：230℃；不分流进样；进样量：1 μL；程序升温：初始温度120℃，保持 2 min，然后以10℃/min升温到160℃，再以20 ℃/min 升温到200℃，保持20 min；

质谱条件如下：电离方式为电子轰击源，色谱质谱接口温度为250℃，离子源温度为220℃，电离能量为70 eV，溶剂延迟：3.0 min，选择离子监测模式。

2.根据权利要求1所述的分离测定唾液中有机酸物质的方法，其特征在于：步骤（1）中的脱脂棉的质量为0.2-2.0 g。

3.根据权利要求1所述的分离测定唾液中有机酸物质的方法，其特征在于：步骤（1）中唾液离心转速不低于10000 rpm，离心时间不少于10 min。

4.根据权利要求1所述的分离测定唾液中有机酸物质的方法，其特征在于：步骤（2）中唾液移取量为0.5-10 mL，涡旋振荡转速为100-20000 rpm，涡旋振荡时间为0.5-10 min，离心转速不低于10000 rpm，离心时间不少于5 min。

5.根据权利要求1所述的分离测定唾液中有机酸物质的方法，其特征在于：所述的甲酯化反应是将加入促甲酯化反应试剂的第一萃取液中移入微波萃取罐中并密闭，放入微波萃取系统中在50-80℃条件下进行甲酯化反应，反应时间为1-10 min；

或者所述的甲酯化反应是将加入促甲酯化反应试剂的第一萃取液中移入密闭的锥形瓶中，在加热50-80℃条件下进行甲酯化反应，反应时间为2-30 min。

6.根据权利要求4所述的分离测定唾液中有机酸物质的方法，其特征在于：步骤（3）中萃取次数为1-2次。

7.根据权利要求6所述的分离测定唾液中有机酸物质的方法，其特征在于：步骤（4）中收集到的萃取液在35℃水浴中减压蒸发浓缩至近干，用正己烷1.0-5.0 mL复溶，过0.22 μm滤膜后进样分析。