[发明专利]基于LC‑MS/MS的胆汁和血清中16种胆汁酸的定量

说明书

技术领域

本发明涉及质谱检测领域，具体地涉及多种胆汁酸高效液相色谱质谱联用法检测试剂盒。

背景技术

胆汁酸是肝脏中细胞色素氧化胆固醇的产物，在肠道消化吸收脂肪和机体维持胆固醇平衡上起着重要的作用。胆汁酸是胆汁中的主要成分，是人体内环境中重要的生理介质之一，主要有胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸和熊脱氧胆酸，以及这5种游离胆汁酸对应的甘氨和牛磺结合型胆汁酸。健康人的胆汁和外周血液中，胆汁酸谱组分相对恒定；发生胆石症、动脉粥样硬化、高血压等多种疾病时，会引起人体胆汁酸代谢异常，导致血清中相应胆汁酸含量的改变。因此，通过胆汁、血清胆汁酸谱的检测，可以了解机体胆汁酸的代谢，并有助于疾病的临床诊治。

不同的胆汁酸在机体内具有不同的生理作用，例如在十二指肠中胆汁酸主要以氨基酸结合型形式存在，这有利于其在十二指肠中的溶解，促进脂肪的消化，此外熊脱氧胆酸还是治疗原发性胆汁性肝硬化的标准方法。然而目前临床对血清和胆汁中胆汁酸的常规检测仅限于总胆汁酸测定，检测结果对疾病的诊断、治疗的指导作用有限。因此检测每一种胆汁酸在体内的水平而非简单地定量总胆汁酸含量，对于了解胆汁酸相关的生理和病理状态是非常重要的。

胆汁酸从结构上分为非结合性胆汁酸、氨基酸结合型胆汁酸、牛磺结合型胆汁酸等。因胆汁酸与其结合物的结构性质差异很大，例如非结合型胆汁酸水溶性差、pKa值一般在3-5之间，而结合型胆汁酸具有更好的水溶性和更低的pKa，在血清中胆汁酸浓度水平很低以及可能同时存在多个同分异构体等原因，对其进行同时分离和检测时非常困难的。本研究建立和验证了一个基于LC-MS/MS的同时16种胆汁酸的准确定量方法，该方法灵敏度高、适用于包括血清、胆汁酸在内的多种基质样本，具有巨大的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的就是提供一种检测灵敏度较高并且能够同时定量检测一种或多种胆汁酸。

在本发明的第一方面，提供了一种基于LC-MS/MS的胆汁和血清中16种胆汁酸的定量检测方法，其特征在于，包括步骤：

(1)样品经过内标化处理，所述内标化处理包括8种同位素内标CA-d5，DCA-d5，LCA-d4，GLCA-d4，TCA-d4，TLCA-d5，TCDCA-d5，TUDCA-d5的内标液处理；

(2)进行色谱，其中色谱条件：色谱柱为Capcell Pak C18MG柱，流动相添加剂A为乙酸铵，流动相添加剂B为乙酸铵乙腈，梯度洗脱，

(3)进行质谱检测。

在另一优选例中，所述乙酸铵浓度为10mM，pH＝9，所述乙酸铵乙腈浓度为10mM，pH＝9。

在另一优选例中，所述色谱柱的温度为40℃

在另一优选例中，所述色谱柱的样品池温度为8℃，进样体积为5uL。

在另一优选例中，所述质谱检测的离子源参数为Curtain Gas(CUR)20、Collision Gas(CAD)8、ion spray voltage-4500V、source temperature 600℃、CUR 20.0、GS1 60.0和GS2 65.0。

在另一优选例中，所述样品与内标液比例为100：500。

在另一优选例中，所述样品为100ul，所述内标液为500ul，两者混匀，经37℃氮气吹干后，加入100u L复溶液(甲醇水溶液(1:1，v:v))复溶。

本发明的第二方面，提供了一种用于胆汁和血清中16种胆汁酸的定量检测方法的试剂盒，所述的试剂盒包括：

(1)内标：所述的内标包括8种同位素内标CA-d5，DCA-d5，LCA-d4，GLCA-d4，TCA-d4，TLCA-d5，TCDCA-d5，TUDCA-d5，优选为内标液；

(2)Capcell Pak C18MG柱；

(3)流动相添加剂，所述的流动相添加剂包括：乙酸铵、乙酸铵乙腈。

在另一优选例中，所述的乙酸铵浓度为10mM，pH＝9。

在另一优选例中，所述乙酸铵乙腈浓度为10mM，pH＝9。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式