[发明专利]一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素的方法

权利要求书

1.一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：

(1)制备羧基化聚苯乙烯纳米微球；

(2)利用步骤(1)制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球，制备纳米荧光微球；所述纳米荧光微球中，稀土元素离子、β-二酮体类螯合物和荧光增强协同剂的摩尔比为1∶4∶3；所述稀土元素离子为铽离子和镝离子；

(3)利用步骤(2)制备的纳米荧光微球和喹诺酮类抗生素单克隆抗体，制备纳米微球时间分辨荧光-喹诺酮类抗生素探针；利用步骤(2)制备的纳米荧光微球和兔IgG单克隆抗体制备纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针；

(4)冻干步骤(3)制备的纳米微球时间分辨荧光-喹诺酮类抗生素探针和纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针，得到冻干的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体；

(5)利用喹诺酮类抗生素制备检测线T线，利用羊抗兔二抗制备质控线C线，喷涂、组装获得层析试纸条；

(6)将步骤(4)制备的冻干的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体加入到酶标板的孔中；

(7)取待测样品加入步骤(6)的酶标板的孔中；

(8)向步骤(7)的孔中插入步骤(5)制备的层析试纸条，样品垫一端浸入到所述孔中的液体，浸入后插入荧光读数仪中读数，得到检测结果。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述羧基化聚苯乙烯纳米微球，由包括以下步骤的方法制得：

将10mM苯乙烯单体和0.95mM丙烯酸单体溶解于10mL含0.45mM十二烷基磺酸钠的去离子水中，再加入圆底烧瓶，用磁力搅拌子搅拌均匀；

用高纯氮气将圆底烧瓶中的空气除尽，密封加热至70℃，加入0.15mM过硫酸钾0.5mL，密封隔氧搅拌反应8小时后，降至室温；

将反应液用whatman 2v滤纸过滤，用截留分子量25,000Da的透析袋对去离子水透析5天，收集透析袋内液体，加入0.05％叠氮钠后4℃保存，所述百分比为质量百分比。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述β-二酮体类螯合物为β-萘甲酰三氟丙酮；和/或，所述荧光增强协同剂为三辛基氧化膦和/或菲罗啉。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述纳米荧光微球由包括以下步骤的方法制得：

取步骤(1)制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球，加入10mL去离子水和丙酮混合液，所述去离子水和所述丙酮的体积比为1:1，得反应液A；

使反应液A中羧基化的聚苯乙烯微球的密度为1×10¹⁴个/mL，搅拌均匀，依次加入0.1M三氯化镝50μL、0.1M三氯化铽50μL、0.1Mβ-萘甲酰三氟丙酮400μL、0.1M三辛基氧化膦150μL和0.1M菲罗啉150μL，加热至60℃恒温搅拌避光反应10小时，然后降至室温反应2小时，得反应液B；

将反应液B通过减压蒸馏方式将溶液中的有机溶剂去除，对去离子水透析5天，去除其余剩余小分子物质，收集透析袋内液体，加入0.05％的叠氮钠4℃保存，所述百分比为质量百分比。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述纳米微球时间分辨荧光-喹诺酮类抗生素探针由包括以下步骤的方法制得：

将步骤(2)制备的纳米荧光微球，溶于10mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，使荧光微球密度约为1.0×10¹²个/mL，400W超声处理30秒，然后缓慢加入15mg/mL的碳二亚胺200μL，得反应液Ⅰ；

将反应液Ⅰ在室温条件下匀速搅拌温育15分钟后，150000g离心10分钟，收集沉淀，用0.01M pH 8.0的硼酸缓冲液反复洗涤沉淀，重复离心步骤2次，即得活化的荧光微球；

将活化的荧光微球复溶于5mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，加入250μg喹诺酮类抗生素单克隆抗体，4℃搅拌反应12小时，得反应液Ⅱ；

将反应液Ⅱ12000g离心10分钟，收集沉淀，将该沉淀复溶于含1.5％海藻糖和2％牛血清白蛋白的、0.01M pH7.4的磷酸缓冲液中，所述百分比为质量体积百分比。