[发明专利]一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素的方法

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素的方法。

背景技术

时间分辨荧光分析法(Time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA)是上世纪80年代提出的一种较为新型的检测手段，TRFIA是用稀土离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,与其螯合剂、增强液(有一部分不需要)在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生反应后,用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。TRFIA与化学发光、电化学发光免疫检测技术并称为三大超灵敏检测技术，在食品检测、医学临床检测、生物学科研检测以及环境检测等方面有较为广泛的应用。

由于稀土元素络合物的荧光强度都较低，因此需要采用荧光增强技术来提高检测灵敏度。目前，根据信号增强技术的不同，TRFIA可分为三种类型，解离再增强技术(DELFIA)、Cyber Fluor系统和基于纳米微球的TRFIA(Nano-TRFIA)。其中，Nano-TRFIA是一种全新的时间分辨荧光检测手段，它结合了稀土元素荧光的长寿命和纳米微球的信号放大效应，将稀土元素及其配合物共同掺杂在纳米及微球上，经过表面活化后，将抗体标记于标记物表面，形成复合物，将该复合物用于免疫检测，可极大地提高灵敏度，并获得较为宽阔的线性范围。

喹诺酮类抗生素是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药。喹诺酮类以细菌的脱氧核糖核酸(DNA)为靶，妨碍DNA回旋酶，进一步造成细菌DNA的不可逆损害，达到抗菌效果。1979年合成诺氟沙星，随后又合成一系列含氟的新喹诺酮类药，通称为氟喹诺酮类。喹诺酮类药物分为四代，目前临床应用较多的为第三代，常用药物有诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、氟罗沙星等。此类药物对多种革兰阴性菌有杀菌作用，广泛用于泌尿生殖系统疾病、胃肠疾病，以及呼吸道、皮肤组织的革兰阴性细菌感染的治疗。目前亟待获得快速、简便、可靠、准确地检测喹诺酮类抗生素的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对现有的、缺乏快速、简便、可靠、准确地检测喹诺酮类抗生素的方法不足，提供一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素的方法。所述的方法能够快速、可靠、准确地检测喹诺酮类抗生素的含量，并且灵敏度高、重复性好、稳定性高、节约时间。该方法能够广泛用于商业化对喹诺酮类抗生素的检测。

针对检测喹诺酮类抗生素的目的，本发明的发明人对纳米微球时间分辨荧光探针的结构，尤其是对其组成部分纳米荧光微球的制备原料中稀土元素离子的品种——铽元素和镝元素进行特殊选择，从而使制备的纳米荧光微球的荧光强度极大地提高，并使稀土元素离子、β-二酮体类螯合物和荧光增强协同剂的摩尔比为1∶4∶3，通过上述改进，提高了利用含有该纳米荧光微球的纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素含量的灵敏度、准确性和可靠性。

本发明的技术方案是：一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素的方法，其包括以下的步骤：

(1)制备羧基化聚苯乙烯纳米微球；所述羧基化聚苯乙烯纳米微球的直径为60±8nm；

(2)利用步骤(1)制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球，制备纳米荧光微球；所述纳米荧光微球中，稀土元素离子、β-二酮体类螯合物和荧光增强协同剂的摩尔比为1∶4∶3；所述稀土元素离子为铽离子和镝离子；

(3)利用步骤(2)制备的纳米荧光微球和喹诺酮类抗生素单克隆抗体，制备纳米微球时间分辨荧光-喹诺酮类抗生素探针；利用步骤(2)制备的纳米荧光微球和兔IgG单克隆抗体制备纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针；

(4)冻干步骤(3)制备的纳米微球时间分辨荧光-喹诺酮类抗生素探针和纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针，得到冻干的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体；

(5)利用喹诺酮类抗生素制备检测线T线，利用羊抗兔二抗制备质控线C线，喷涂、组装获得层析试纸条；

(6)将步骤(4)制备的冻干的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体加入到酶标板的孔中；

(7)取待测样品加入步骤(6)的酶标板的孔中；