[发明专利]一种用于快速检测华法林个体化用药相关基因CYP2C9和VKORC1多态性的试剂盒

权利要求书

1.一种检测华法林个体化用药相关基因CYP2C9和VKORC1多态性的试剂盒，其特征在于：包括检测基因CYP2C9*3(1061A/C)和VKORC1(-1639G/A)遗传多态性的引物及探针。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

其中，所述试剂盒包括检测基因CYP2C9(1061A/C)的一个正向引物、一个反向引物及两个检测探针的检测引物探针组合1；检测基因VKORC1(-1639G/A)的一个正向引物、一个反向引物及两个检测探针的检测引物探针组合2；以及检测内参基因的一个正向引物、一个反向引物及一个内控探针的内控引物探针组合。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：

其中，所述CYP2C9(1061A/C)基因多态性的检测引物探针组合1，包括：

正向引物：CYP2C9F：5’-CCCTGCATGCAAGACAGGAG-3’

反向引物：CYP2C9R：5’-ACTTACCTTGGGAATGAGATAG-3’

检测探针：probe1：5’-FAM-TCCAGAGATACATTGACCTTCTCCCC-BHQ2-3’

检测探针：probe2：5’-FAM-TCCAGAGATACCTTGACCTTCTCCCC-BHQ2-3’。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：

其中，所述VKORC1(-1639G/A)基因多态性的检测引物探针组合2，包括：

正向引物：VKORC1F：5’-GTAAGGGATCCCTCTGGGAAG-3’

反向引物：VKORC1R：5’-CACCATGTTGGCCAGGCTTG-3’

检测探针：probe3：5’-CY5-CCACCGCCACCCGGCCAATGGTT-BHQ2-3’

检测探针：probe4：5’-CY5-CCACCGCCACCTGGCCAATGGTT-BHQ2-3’。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：

所述内控引物探针组合，包括：

正向引物：Cont F：5’-CATTCTAAACTGTACCCTGTTACT-3’

反向引物：Cont R：5’-GCCACACTGAGTGAGCTGCACTG-3’

检测探针：probe5：5’-ROX-CCTTCCTATGACATGAACTTAACC-BHQ2-3’。

6.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：

其中，使用引物进行PCR扩增的条件为：温度为95℃，时间为3分钟；再次依照以下程序运行40个循环，变性：温度为95℃，时间为15秒，退火：温度为60℃，时间为20秒，延伸：温度为72℃，时间为30秒。

7.一种利用如权利要求1-6中任意一项所述的检测华法林个体化用药相关基因CYP2C9和VKORC1多态性的试剂盒进行CYP2C9和VKORC1多态性检测的方法，包括步骤：

(1)待测样本处理和模板提取

抽取待检测者的血液样本，保存于抗凝采集管中；从血液样本中获取DNA；测定DNA的浓度和纯度，要求浓度不小于50ng/μl；OD260nm/OD280nm在1.7～2.0之间；

(2)荧光PCR扩增

将待检测模板DNA加入含有本发明所述CYP2C9和VKORC1多态性特异检测引物探针组合及内控引物探针的多色荧光PCR反应液内，在荧光PCR管内混合均匀离心后，放入荧光定量PCR仪器进行PCR反应；

(3)结果分析

在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，判断实验结果的特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增“S”型曲线，如果对应的目的检测荧光信号呈对数扩增“S”型曲线则该待检测DNA样本判定为该信号所对应的基因表型为阳性。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于：

其中，荧光PCR扩增步骤中采用以下温度循环及信号采集程序进行PCR反应：

温度为95℃，时间为3分钟；再次依照以下程序运行40个循环， 变性：温度为95℃，时间为15秒，退火：温度为60℃，时间为20秒，延伸：温度为72℃，时间为30秒。