[发明专利]C-反应蛋白免疫胶乳微球制备方法及应用

权利要求书

1.一种C-反应蛋白免疫胶乳微球制备方法，步骤如下：

1)准备粒径范围50～200nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.8～1.2％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液；

2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液；

3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加50～60μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震荡活化1h，震荡速度为30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；

4)将浓度≥10mg/mL的CRP多克隆抗体在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.5～2mg/mL之间，得到CRP多克隆抗体溶液，储存于2～8℃备用；

5)将CRP多克隆抗体溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.05～0.2:1，整个滴加过程持续4～7min，使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合，两者的混合液呈中性，之后0～4℃震荡12～24h，震荡速度为30～50r/min，即得C-反应蛋白免疫胶乳微球。

2.根据权利要求1所述的C-反应蛋白免疫胶乳微球制备方法，其特征在于：所述步骤3)中震荡活化条件为：4℃震荡活化1h，震荡速度为50r/min。

3.根据权利要求1或2所述的C-反应蛋白免疫胶乳微球制备方法，其特征在于：所述步骤5)中使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合时，4℃震荡16h，震荡速度为50r/min。

4.一种胶乳增强免疫比浊法C-反应蛋白测定试剂盒，其特征在于：包括C-反应蛋白检测试剂R1和C-反应蛋白检测试剂R2；

所述C-反应蛋白检测试剂R1中各组分及含量为：0.01～13％稳定剂1、10～200mM的缓冲液1、1～6％的促凝剂1、0.02～0.1％的防腐剂1；

所述C-反应蛋白检测试剂R2中各组分及含量为：0.01～23％稳定剂2、1～5mg/ml的C-反应蛋白免疫胶乳微球、10～200mM的缓冲液2、0.02～0.1％的防腐剂2；

其中，所述稳定剂1选自0.5～1.8％的氯化钠、0.1～1％的BSA、1～20mM的乙二胺四乙酸二钠、0.01～1％的Triton X-100中的一种或两种以上；

所述缓冲液1选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上；

所述促凝剂1选自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或硫酸葡聚糖中的一种；

所述防腐剂1选自叠氮钠、Proclin300或硫柳汞中的一种；

所述稳定剂2选自0.5～1.8％的氯化钠、0.2～3％的BSA、1～20mM乙二胺四乙酸二钠、0.01～1％的Triton X-100、1～10％的丙三醇中的一种或两种以上；

所述缓冲液2选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上；

所述防腐剂2选自叠氮钠、Proclin300或硫柳汞中的一种；

所述C-反应蛋白检测试剂R2的制备方法为：

1)准备粒径范围50～200nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.8～1.2％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液；

2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液，

3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加50～60μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震荡活化1h，震荡速度为30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；

4)将浓度≥10mg/mL的CRP多克隆抗体在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.5～2mg/mL之间，得到CRP多克隆抗体溶液，储存于2～8℃备用；

5)将CRP多克隆抗体溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.05～0.2:1，整个滴加过程持续4～7min，使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合，两者的混合液呈中性，之后0～4℃震荡12～24h，震荡速度为30～50r/min，即得C-反应蛋白免疫胶乳微球；

6)向C-反应蛋白免疫胶乳微球中加入含有稳定剂2和缓冲液2的封闭液，震荡得到胶乳溶液；

7)胶乳溶液离心，去上清液，以除去其中残留的活化剂，然后加入包含防腐剂2的贮存液至贮存浓度，超声分散，即得。