[发明专利]C-反应蛋白免疫胶乳微球制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种C‑反应蛋白免疫胶乳微球制备方法及应用，C‑反应蛋白免疫胶乳微球制备方法优化化学交联方法，将聚苯乙烯微球的羧基在低pH条件下活化，与高pH条件溶解的抗体上的氨基耦合，两者的混合液呈中性，在低温下偶联12～24h，既保证了抗体的偶联效率，同时极大程度的降低了活化剂对抗体活性的破坏。采用本发明方法制备的免疫胶乳微球制成的胶乳增强免疫比浊法C‑反应蛋白测定试剂盒具有灵敏度高、定量准确、重复性好、性质稳定的特点，其定量的线性范围在0.1～20mg/L，可应用于全自动生化分析仪或凝血分析仪，操作快速、简单，从检测至采集结果只需5～10分钟，具有较好的临床应用前景。

技术领域

本发明涉及医学免疫诊断领域，具体地指一种C-反应蛋白免疫胶乳微球制备方法及应用。

背景技术

C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是一种在白介素-6的介导下主要由肝脏产生的急性期反应蛋白，急性期浓度可升高上千倍。

CRP无论在人或动物体内均是急性时相反应蛋白中重要的蛋白之一，是一种敏感的炎症标志物，在急性创伤和感染时其血浓度急剧升高。正常动物血清CRP含量很低，但在感染、炎性、手术及肿瘤等情况下，几个小时迅速升高，在狗体内24～48小时可达高峰。病变消退后，CRP可迅速下降至正常，所以可作为动物细菌和病毒感染的一个首选指标，防止抗生素滥用和减少食品带来的健康问题。

1977年Sternberg创建了速率散射比浊法，是以测定的溶液对光的散射程度来判断样品中抗原的含量。一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物可导致光散射，散射强度与抗原抗体免疫复合物的含量成正比。但免疫比浊法由于检测灵敏度达不到临床的要求，于是出现了胶乳增强免疫比浊法。其基本原理是首先将抗体吸附在一种胶乳颗粒上，当遇到相应的抗原时，抗原抗体结合而出现胶乳凝集。单个胶乳颗粒的大小在入射光波长之内，光线可透过。当两个以上胶乳颗粒凝集可阻碍光线透过，使透射光减少，其减少程度与胶乳凝集的程度成正比，亦与抗原成反比。

现有技术中常采用聚苯乙烯微球偶联抗体，得到用于检测的胶乳试剂，但偶联效率普遍偏低，只有60～80％，且偶联时碳化二亚胺类活化剂对抗体活性破坏较大，导致产品成品率低。

发明内容

本发明的目的就是要克服现有C-反应蛋白免疫胶乳微球制备方法产品成品率低的缺陷，提供一种偶联效率高、偶联后抗体活性影响小的C-反应蛋白免疫胶乳微球制备方法及由采用该C-反应蛋白免疫胶乳微球的胶乳增强免疫比浊法C-反应蛋白测定试剂盒。

为实现上述目的，本发明所提供的C-反应蛋白免疫胶乳微球制备方法，步骤如下：

1)准备粒径范围50～200nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.8～1.2％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液；

2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液；

3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加50～60μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震荡活化1h，震荡速度为30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；

4)将浓度≥10mg/mL的CRP多克隆抗体在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.5～2mg/mL之间，得到CRP多克隆抗体溶液，储存于2～8℃备用；

5)将CRP多克隆抗体溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.05～0.2:1，整个滴加过程持续4～7min，使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合，两者的混合液呈中性，之后0～4℃震荡12～24h，震荡速度为30～50r/min，即得C-反应蛋白免疫胶乳微球。