[发明专利]检测毒死蜱的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测毒死蜱的酶联免疫试剂盒，其特别适于蔬菜、水果和茶叶中毒死蜱含量的检测。

背景技术

毒死蜱(Chlorpyrifos)，化学名称O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，商品名为毒死蜱、乐斯本、白蚁清等，是甲胺磷和甲基对硫磷等高效农药的新型高效、低毒替代品种，属于广谱型有机磷酸酯类杀虫剂，可用于粮食、蔬菜、水果及经济作物的害虫防治。毒死蜱是农产品与食品中农药残留监测的重要目标物之一，不仅在农作物中的残留日益严重，而且可以通过代谢等途径向环境中转移，对人类健康构成潜在威胁，它会影响大脑发育，对甲状腺系统产生作用，导致血液甲状腺素浓度降低，过量摄取可能会引起痉挛以及眩晕，尤其对儿童健康危害较大。

有鉴于此，发达国家对毒死蜱的使用进行了严格的规定，并不断提高毒死蜱在农产品中的残留限量。欧盟对菠菜中毒死蜱的最高限量为0.05mg/kg；日本对毒死蜱的国家标准最为严格，其2002年4月公布的农残限量标准表中，其菠菜的毒死蜱限量为0.01mg/kg；国际食品法典委员会(CAC)对菠菜中毒死蜱残留限量为0.05mg/kg。我国最高残留限量国家标准为：粮食0.1mg/kg；梨果、叶菜1mg/kg；棉籽油0.05mg/kg。

因此，为了预防和应对毒死蜱残留引起的环境和食品污染问题，有必要建立一种灵敏、简便、快速的毒死蜱检测方法。目前毒死蜱的残留检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、气-质联用法(GC-MS)。采用这些分析方法需要昂贵的仪器和专门的技术人员，样品前处理过程复杂且花费高、费时长，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。酶联免疫吸附分析法(ELISA)具有简便快速、特异灵敏、样品容量大、分析成本低的特点，可以简化甚至省去样品净化步骤，在大量样本和现场样本快速筛选检测中显示出独特优势，能够更好地满足我国食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作，极具发展潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结构简单、使用方便、价格便宜、便于携带的用于毒死蜱检测的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样本筛选的定性、定量检测方法。

本发明试剂盒，它包括：包被有毒死蜱偶联抗原的酶标板、毒死蜱单克隆抗体、酶标记抗抗体、毒死蜱标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液；所述毒死蜱偶联抗原是由毒死蜱半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原，所述毒死蜱半抗原是由毒死蜱原药在碱性条件下与氨基丁酸在吡啶环上与邻近氮原子的氯进行亲核取代反应得到，分子结构式为：

所述毒死蜱单克隆抗体是以毒死蜱偶联抗原作为免疫原制备获得。

所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。

所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶；酶标记的抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括毒死蜱标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。

所述毒死蜱标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.6μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、16.2μg/L和48.6μg/L。

所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1～2mol/L的硫酸溶液。

所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠的0.1～0.3mol/L磷酸盐缓冲液。

所述复溶液优选为pH值为7.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白的0.1～0.3mol/L磷酸盐缓冲液。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/mL，每孔加入100μL，37℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μL封闭液，37℃避光孵育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明的检测原理为：