[发明专利]一种NK细胞无血清培养基

说明书

技术领域

本发明涉及一种NK细胞无血清培养基及其配制方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术

无血清培养基是指不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基，可以应用于培养免疫细胞，例如淋巴细胞(例如，T淋巴细胞、B细胞、NK细胞等)、树突状细胞(也称DC细胞)、单核/巨噬细胞等。

通常来说，免疫细胞在体外存活和扩增所需要的营养物质包括：白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、氨基酸、维生素、糖、脂质、无机盐、生长因子等。这些成分中，白蛋白对细胞生长和存活的影响最大，也是功能和组成最复杂的成分。而无血清培养基中，白蛋白所发挥的功能主要是由它所携带的脂肪酸和微量元素等成分决定的。

不同来源的白蛋白，例如不同种属的牛白蛋白和人白蛋白，它们所携带的脂肪酸差异很大；例如，重组白蛋白与人血白蛋白所携带的脂肪酸不同；例如在重组白蛋白中，水稻胚乳提取的与酵母菌发酵生产的重组白蛋白所携带的脂肪酸不同；不同产地的，也有不同。另外，后期生产加工过程也会造成白蛋白所携带的脂肪酸差异，例如不同生产厂家生产的、不同的批次的白蛋白所携带的脂肪酸也有很大的不同。总之，以上这些差异就导致添加了白蛋白的无血清培养基的成分复杂、不稳定。

无血清培养基中添加的白蛋白，其所携带的脂肪酸被细胞摄取后，用于构建细胞膜结构、信号传导分子、转化成能量、或者参与其它物质的合成等。因此，培养基中的白蛋白所携带的脂肪酸的差异会影响到免疫细胞的生长增殖、细胞功能等各个方面。特别是，往往某些脂肪酸含量过高或过低也会不利于免疫细胞的增殖及其杀伤活性，比如过高含量的亚麻酸或过低含量的亚油酸对免疫细胞增殖和杀伤活性不利。

特别是，对于淋巴细胞来说，体外富集、活化，并扩增淋巴细胞，可用于回输治疗多种诸如恶性肿瘤、感染、自身免疫病的疾病。然而，在体外扩增的过程中，需要用到适宜体外支持淋巴细胞存活和扩增的培养基。

目前，一些文献公开了一些无血清培养基，例如适合培养T淋巴细胞的无血清培养基，但都没有公开针对白蛋白的组成复杂性的解决方案，也没有公开一种专门培养NK细胞的无血清培养基。

另外，利用目前市售的培养基培养的NK细胞扩增倍数低、存活时间短、活性低，不能满足临床应用的问题。

发明内容

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明提供了一种成分更稳定的NK细胞无血清培养基及其配制方法，改善了因白蛋白的组成复杂性而导致的培养基成分不稳定的情况。本发明的培养基中还加入了聚肌胞[Poly(I:C)]，聚肌胞可诱导免疫细胞的分化、成熟或者分泌细胞因子，如IL-12、IL-15、TNFa、IFN-r等，促进免疫细胞的活化增殖的能力；聚肌胞还可以促进膜结合型IL-15Ra表达的能力，IL-15Ra可与IL-15紧密结合，这种结合状态的IL-15对NK细胞有更强烈的促活化和促增殖的效应。本发明提供的NK细胞无血清培养基更适合高效培养NK细胞，提高增值倍数。

本发明提供了一种应用于NK细胞无血清培养基，所述NK细胞无血清培养基包括基础培养基、适用于所述NK细胞无血清培养基的血清替代物、聚肌胞，所述血清替代物包含白蛋白、人转铁蛋白、胰岛素和胆固醇，所述白蛋白是通过在无脂肪酸白蛋白上负载脂肪酸而形成的。

优选的，所述白蛋白是通过在无脂肪酸白蛋白上负载特定的脂肪酸而形成的；所述特定的脂肪酸由棕榈酸和/或硬脂酸、油酸和亚油酸组成；按照每1mmol无脂肪酸白蛋白添加0.4-2mmol的棕榈酸和/或硬脂酸，0.4-2mmol的油酸和0.4-2mmol的亚油酸的比例，将所述特定的脂肪酸添加到所述无脂肪酸白蛋白的溶液中混合而形成。

优选的，所述特定的脂肪酸还包括花生四烯酸，所述花生四烯酸与所述亚油酸的添加量的比值为1:6～1:1。

优选的，所述特定的脂肪酸包括棕榈酸和硬脂酸、油酸和亚油酸，所述硬脂酸与所述棕榈酸的添加量的比值为1:6～1:1。

优选的，所述NK细胞无血清培养基中，所述白蛋白的添加量为0.015～0.15mmol/L，以基础培养基的体积为基准。

优选的，所述的白蛋白为牛血清白蛋白、人血白蛋白或重组人血白蛋白。

优选的，所述的重组白蛋白为水稻胚乳表达的重组人血白蛋白或者转基因酵母菌表达的重组人血白蛋白。

优选的，所述的基础培养基为IMDM培养基，以基础培养基的体积为基准，所述人转铁蛋白的添加量为1～100mg/L，所述胰岛素的添加量为1～100mg/L，所述胆固醇的添加量为1～10mg/L。