[发明专利]一种农杆菌介导的寡雄腐霉遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物基因工程技术领域，具体为一种农杆菌介导的寡雄腐霉遗传转化方法。

背景技术

寡雄腐霉属于卵菌门腐霉科腐霉属，是一种土壤习居型腐生菌，其能够在多种重要的农作物根围定殖，对植物和动物都没有毒性，对环境安全。寡雄腐霉的菌丝可以寄生于病原菌体内，干扰寄主的代谢活动，消耗细胞内的养分，造成病菌死亡，同时，还能合成色胺，色氨酸，吲哚乙酸等生长活性物质，促进植物生理代谢，养分吸收和生长发育。寡雄腐霉不仅对多数致病真菌有很强的寄生或拮抗作用，并且能诱导农作物产生系统抗性，是一种非常有应用价值的生防真菌。对其进行更进一步的研究利用，特别是从分子水平对其进行基因功能利用、遗传性状改良等方面研究势在必行。

农杆菌是广泛存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，其细胞中存在Ti质粒，包含可转移的T-DNA区域。在农杆菌侵染受体细胞后，T-DNA可与受体材料的基因组DNA结合并稳定遗传。农杆菌介导的基因转化方法最先也是最广泛地应用于植物，近年来也多为成功的应用于丝状真菌。与传统的真菌遗传转化方法相比，农杆菌介导的转化方法对受体材料要求简单、能得到较多单拷贝的T-DNA插入转化子、转化率更高、转化子稳定遗传性高，此种方法更适合于丝状真菌的DNA插入突变、基因标记、基因改造等方面的研究。

虽然丝状真菌转化的基本过程相同，但不同真菌转化所需要的转化参数存在差异，需要针对不同真菌的转化条件进行摸索。目前国内外未见关于农杆菌介导的寡雄腐霉遗传转化研究的报道。参考其他丝状真菌的转化方法无法顺利进行转化。

传统的农杆菌介导的遗传转化方法中，农杆菌与侵染对象混合后采用硝酸纤维素膜或滤纸等辅助的固体培养方式对转染的细菌或真菌进行共培养及选择培养，需要在培养基平板上铺膜，揭膜再铺膜的一系列操作步骤，过程繁杂，易污染，容易降低转化率，对实验的最终结果造成巨大影响，这一方法亟待改进。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种农杆菌介导的寡雄腐霉遗传转化的方法，通过此方法可得到寡雄腐霉工程菌株，可用于从分子水平上进行寡雄腐霉基因功能、基因改良等相关基因遗传转化的研究应用，并且简化、优化了转化后抗性菌株培养筛选阶段的程序，提高了转化率。

本发明的内容，是提供一种农杆菌介导的寡雄腐霉遗传转化的方法，具体步骤如下：

（1）寡雄腐霉菌丝孢子悬浮液制备。

将寡雄腐霉菌丝接种在PDA平板上培养，用诱导培养基IM冲洗平板，将平板上的寡雄腐霉孢子及部分菌丝冲洗下来，制备为寡雄腐霉孢子菌丝悬浮液。

作为优选，菌丝孢子悬浮液的浓度为1×10^6～7个/mL。

作为优选，诱导培养基IM为：PDB+300μM乙酰丁香酮，pH值为5.0。

（2）包含目的基因载体的农杆菌侵染用菌液制备。

从农杆菌工程菌株抗性平板上挑取单克隆，于5ml LB（Rif+相应载体抗生素）液体培养基中振荡培养活化；吸取上述菌液于新的LB（Rif+相应载体抗生素+乙酰丁香酮）液体培养基中扩大10倍培养； 4℃，5000rmp离心10min，收集菌体，用诱导培养基IM重悬稀释菌体，最终获得的农杆菌菌液浓度OD₆₀₀为0.3～0.7。

作为优选，诱导培养基IM为：PDB+300μM乙酰丁香酮，pH值为5.0。

作为优选，农杆菌菌液浓度OD₆₀₀为 0.6。

（3）农杆菌菌液侵染寡雄腐霉悬浮液。

上述获得的含有目的基因载体的农杆菌菌液与寡雄腐霉悬浮液混合共培养，使农杆菌侵染寡雄腐霉，将目的基因导入寡雄腐霉中。农杆菌菌液与寡雄腐霉悬浮液比例为：1～10 ：1。共培养条件为：避光，25℃， 60rmp培养不少于24h。

作为优选，共培养时间为48-96h。

（4）恢复培养。

向上述农杆菌与寡雄腐霉混合菌液中加入细菌抗生素恢复培养，培养条件为26℃,120rmp培养24～48h。

作为优选，加入的细菌抗生素为头孢霉素，浓度为200 mg/L。

（5）转化子的筛选。

经恢复培养的寡雄腐霉菌液，离心收集菌体，用PDB重悬，涂布添加有抗性选择压的PDA平板，于26℃培养，抗性选择压筛选寡雄腐霉转化子。