[发明专利]乙肝共价闭合环状DNA磁性捕获技术

权利要求书

1. 一种制备HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的方法，其特征在于：步骤如下：

(1)采用化学共沉淀法制备Fe₃O₄纳米粒子；

(2)采用反相乳液法制备硅壳磁性纳米颗粒；

(3)对硅壳磁性纳米颗粒进行亲和素修饰；

(4)偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针；

所述步骤(2)的方法如下：将Triton X-100、正己醇和环己烷按体积比1:1:4混合均匀，加入Fe₃O₄纳米粒子溶液，搅拌均匀，然后加入正硅酸乙酯和氨水，持续搅拌24h，反应结束后，用丙酮破坏乳化，收集颗粒，得硅壳磁性纳米颗粒。

2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)的方法如下：将1.0mol/L FeCl₃溶液与2.0mol/L FeCl₂溶液混合，FeCl₃溶液与FeCl₂溶液的体积比为4:1，加入FeCl₂溶液25倍体积的浓度为0.7mol/L的氨水溶液，离心，得黑褐色沉淀，用FeCl₂溶液15倍体积的 浓度为2.0mol/L的高氯酸溶液分散，水洗至中性，干燥，得Fe ₃O₄纳米粒子。

3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：加入Fe₃O₄纳米粒子溶液的浓度为5mmol/L，加入的量为Triton X-100、正己醇和环己烷混合溶液体积的2/5；正硅酸乙酯和氨水的加入量分别为Triton X-100、正己醇和环己烷混合溶液体积的20倍。

4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的方法如下：将2.5mg/ml 的链霉亲和素溶液加入到硅壳磁性纳米颗粒中，在4℃下恒温振荡培育24h，用PBS缓冲液洗涤颗粒3次，再加入2％的戊二醛溶液在室温下浸泡，得磁性纳米悬浊液。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)的方法如下：

1)纳米预处理：取磁性纳米颗粒混悬液，离心，弃上清，加入结合缓冲液，制成浓度为1μg/μl的磁性微粒悬液，其中，结合缓冲液是Tris-HCl和NaCl的混合溶液，Tris-HCl的浓度为20mmol/L，NaCl的浓度为150mmol/L；

2)探针预处理：将探针配制成浓度为10μM的探针溶液；

3)偶联：在步骤1)制得到的磁性微粒悬液中加入15μl步骤2)制得的探针溶液，在37℃、150rpm/min条件下反应2h；

4)封闭、清洗，即可。

6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中的探针溶液包含4条探针，4条探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～4所示，4条探针的5’端均标记有生物素。

7. 权利要求1～6任意一项所述方法制备得到的HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳 米微球。

8. 一种富集分离HBV cccDNA的方法，其特征在于：步骤如下：取待检样品，加入权利要求7所述HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球，混匀，在外磁场环境中作用20min，去除上清液，通过分子变性解离，即可得到富集分离的cccDNA。