[发明专利]乙肝共价闭合环状DNA磁性捕获技术

说明书

本发明公开了一种乙肝共价闭合环状DNA磁性捕获技术。本发明制备HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的方法，步骤如下：(1)采用化学共沉淀法制备Fe₃O₄纳米粒子；(2)采用反相乳液法制备硅壳磁性纳米颗粒；(3)对硅壳磁性纳米颗粒进行亲和素修饰；(4)偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针。本发明还公开了前述方法制备得到的探针磁性纳米微球，以及应用该微球富集HBV cccDNA的方法。本发明方法制备的HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球，可以有效特异捕获HBV cccDNA，能够实现HBV cccDNA的高效快速富集分离的，分离方法简单，应用前景良好。

技术领域

本发明涉及一种富集分离乙肝共价闭合环状DNA的方法。

背景技术

慢性乙型肝炎是由于感染乙型肝炎病毒(HBV)引起的疾病，目前尚无特效药能够治愈。而HBV cccDNA是乙肝病毒持续感染、难以治愈的关键因素，通过检测HBV cccDNA可以了解HBV感染状态及传染性，评价药物治疗HBV的疗效，帮助了解机体清除HBV的程度，为临床医生判断何时停止抗病毒治疗及停止治疗后HBV是否会重新复制活跃导致乙肝复发提供一个客观指标，也是评价肝外组织是否被HBV感染以及在肝移植中评价移植肝脏是否被再感染的指标。

国内外学者已建立了许多检测HBV cccDNA的方法，如，Southern印迹杂交法、PCR法等等。但是由于分离富集得到较高纯度的ccc DNA非常难，导致检测的特异性和敏感度均不理想。影响ccc DNA富集的难度主要体现在以下两个方面：(1)体内与cccDNA序列同源性较高其他形的HBV DNA的干扰，比如成熟病毒颗粒中的松rcDNA；部分病毒颗粒中存在dslDNA及由前基因组RNA反转录形成的ss D NA。(2)细胞内ccc DNA的含量较少，获取高纯度的ccc DNA难度较大。

因此，有效分离富集得到高纯度的ccc DNA极为重要。

磁性分离技术是以纳米或微米级的磁性微粒为载体，利用结合于磁性微粒表面功能化基团特异亲和特性，在外加磁场的定向控制下，通过亲和吸附、清洗、解吸操作，从复杂的生物体系中一步分离到目标物分子。

它具有磁性分离简单方便、亲和吸附高特异性及高敏感性等众多优点。国内外众多学者都利用超顺磁性纳米粒子的小尺寸效应和生物素与亲和素的亲和作用，构建了具超顺磁性的DNA纳米富集技术来特异性地结合目标单链寡聚核苷酸，从而可实现对互补单链核苷酸片段的高效快速富集分离的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种采用磁性纳米技术分离富集HBV cccDNA的方法以及HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球。

本发明制备HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的方法，其特征在于：

(1)采用化学共沉淀法制备Fe₃O₄纳米粒子；

(2)采用反相乳液法制备硅壳磁性纳米颗粒；

(3)对硅壳磁性纳米颗粒进行亲和素修饰；

(4)偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针。

所述步骤(1)的方法如下：将1.0mol/L FeCl₃溶液与2.0mol/L FeCl₂溶液混合，FeCl₃溶液与FeCl₂溶液的体积比为4:1，加入FeCl₂溶液25倍体积的浓度为0.7mol/L的氨水溶液，离心，得黑褐色沉淀，用FeCl₂溶液15倍体积的浓度为2.0mol/L的高氯酸溶液分散，水洗至中性，干燥，得Fe₃O₄纳米粒子。