[发明专利]一种虫草类药材样品中两种微量核苷的检测方法

说明书

本发明公开了一种在线固相萃取‑HPLC法测定虫草类样品中两种微量核苷3’‑脱氧腺苷(虫草素)和其同分异构体2’‑脱氧腺苷(异虫草素)的方法：采用固相萃取‑HPLC法进行检测，固相萃取柱为ZORBAXSB‑AQ(12.5mm×4.6mm，5μm)，分析柱为ZORBAX SB‑AQ(150mm×4.6mm，5μm)。色谱条件为去离子水‑甲醇(91:9)冲洗固相萃取柱3min，除去杂质；六通阀切换使固相萃取柱与分析柱连通，3‑5min时流动相逐渐转化为0.1％甲酸水溶液‑甲醇(91:9)，继续洗脱12min。进样体积为40μL，流速为1mL/min，柱温40℃，检测波长为260nm。本发明方法检测时间极大缩短，操作简单，专属性强，适用于虫草类样品中虫草素和异虫草素的同时快速分析，采用六通阀切换流路，避免杂质进入分析柱，保护分析柱。

技术领域

本发明涉及药材中特定成分含量的分析检测方法，具体涉及一种在线固相萃取-HPLC法快速分析虫草类样品中两种微量核苷类成分3’-脱氧腺苷和2’-脱氧腺苷的方法。

技术背景

虫草是寄生于昆虫、少数真菌和植物体上的一类真菌，是广义虫草属真菌的总称，是具有营养、保健和医疗功效的宝贵生物资源，目前我国的虫草产业涉及了冬虫夏草、蛹虫草、蝉花及其相关真菌的发酵菌丝体等，已经形成了一个巨大的产业，实现了较高的经济价值和社会效益。虫草素是最早从蛹虫草(Cordyceps militaris)中分离得到的一种物质，化学名称为3′-脱氧腺苷，也是第一个从真菌中分离出来的抗菌性物质，之后许多学者对其进行了验证研究。现代药理学研究表明虫草素还具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、清除自由基等多种药理作用。冬虫夏草中虫草素的存在与否一直存在争议。2′-脱氧腺苷也是广泛存在于虫草类物种中的一种成分，是虫草素的同分异构体，其俗名为异虫草素，其与虫草素仅一个羟基位置有所差异，两者结构如下式所示。由于两者结构非常相似，分子量相同，分离较难，紫外光谱相似，容易造成错误判断。目前主要通过高效液相-质谱联用的方法对两种成分进行分离和定量分析，操作复杂，对仪器要求较高。

固相萃取技术(Solid Phase Extraction,SPE)是色谱分析样品重要的前处理方法，可将痕量被测组分进行浓缩富集，使样品净化后将被测组分从样品基体中转移到溶剂或气体中进行分析检测。目前SPE技术已广泛应用于中药材中的微量物质分析。但是离线SPE在提取、洗脱后仍需溶剂挥干和重溶等步骤，耗时耗力，易造成待测物质的损失。

经本申请发明人的研究还发现，很多技术文献使用HPLC方法所测定的虫草素并非真正的3′-脱氧腺苷峰，而是2′-脱氧腺苷或者是与其同分异构体3′-脱氧腺苷混合物的峰。而且由于虫草类样品中3′-脱氧腺苷和2′-脱氧腺苷含量低，使用普通的紫外检测器很难检测，一般需使用高效液相色谱联合价格昂 贵的质谱仪才能进行检测，不易准确反映样品中虫草素和异虫草素的真实含量。

发明内容

本发明以3′-脱氧腺苷和2′-脱氧腺苷为对照品，通过在线固相萃取-HPLC分析方法，能够测定虫草类样品中两者的准确含量。本发明将为虫草素新的生产和开发工艺提供一种简单快速、价格低廉的分析方法。

本发明的目的在于提供一种快速、简便、稳定而又准确的测定虫草类样品中3′-脱氧腺苷和2′-脱氧腺苷的在线固相萃取-HPLC方法。本发明通过使用两种对照品和优化色谱条件，成功地将原来被认为是3′-脱氧腺苷峰的单峰分离为3′-脱氧腺苷峰和2′-脱氧腺苷峰，将能更加准确地反映虫草类样品中3′-脱氧腺苷和2′-脱氧腺苷的含量。

本发明提供了一种在线固相萃取-HPLC法分析虫草类样品中3’-脱氧腺苷和2’-脱氧腺苷的分析方法，包括以下测定步骤：

a、供试品溶液的制备：准确称取样品粉末适量，置于离心管中，加入适量超纯水，混匀，超声提取，摇匀，离心，取上清液过膜，即得供试品溶液；