[发明专利]5‑氯‑8‑羟基‑喹啉及其衍生物在磷酸化蛋白质荧光检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及磷酸化蛋白质荧光检测技术，具体地说涉及磷酸化蛋白质的一种新的荧光染料。

背景技术

在生命科学研究领域，离不开对生命的基本物质蛋白质和DNA的研究，也就离不开对蛋白质的检测技术。尤其是最近几年，随着基因组学和蛋白质组学的飞速发展，使我们对蛋白质的分离检测技术有了更高的要求。

蛋白质的检测方法有很多，包括浊度法、凯氏定氮法、吸光光度法、荧光光度法，以及新发展起来的共振瑞利散射法、高效液相色谱法、毛细管电泳分析法等。荧光光度法是目前研究最多、应用最广、操作较为简便、灵敏度较高的检测方法。

蛋白质磷酸化修饰是最常见也是最重要的蛋白质翻译后修饰方式之一，也是目前蛋白质组学研究的热点之一，对于目前的研究尚且存在专属性检测方法的不足，磷酸化过程基本上发生在酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸等氨基酸残基上。蛋白质的这一修饰与细胞的增殖、分化、发育、凋亡等许多生命活动息息相关，据多年的研究证明，蛋白磷酸化与许多的临床疾病有着复杂的关系。因此开发一种专属性强的检测方法成为了研究的突破点。

现存的凝胶上磷酸化蛋白质检测方法包括Pro-Q Diamond检测技术、Westernblot检测技术，以及经典的Stains-All检测技术等。其中Pro-Q Diamond是目前特异性最强、应用最广、操作较为简便、灵敏度较高的检测方法。

本发明首次将5-氯-8-羟基-喹啉及其衍生物应用于磷酸化蛋白质荧光检测，相比于其他检测技术，具有检测限低，专属性强等众多优点，在蛋白质组学研究中将具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于建立一种5-氯-8-羟基-喹啉及其衍生物在磷酸化蛋白质荧光检测中的应用。

本发明所述的5-氯-8-羟基-喹啉相关化合物是指以5-氯-8-羟基-喹啉为母核的钠盐、钾盐或铵盐等。

5-氯-8-羟基-喹啉母核为：

下面是本发明一个可用的凝胶检测方法，其包括步骤：

1)将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于固定液中固定2次，每次10～30min；优选的固定时间为每次15min，固定液可以是含有50％甲醇和10％乙酸的水溶液；

2)弃固定液，加入按摩尔浓度比5～100μM的铝离子，按溶液体积比5～20％的乙醇溶液漂洗2～10min；其中优选的铝离子浓度为50μM，优选的乙醇浓度为10％，优选的漂洗时间为5min；

3)弃铝离子溶液，加入按溶液体积比10～30％的甲醇溶液漂洗5～20min；其中优选的甲醇浓度为20％，优选的漂洗时间为15min；

4)弃去甲醇溶液，加入荧光染色液10～30min，其中所述染色液为含按摩尔浓度比50～100μM的5-氯-8-羟基-喹啉，按摩尔浓度比2～10mM的乙酸钠-乙酸缓冲液(pH＝5.5)，按溶液体积比20～40％的乙醇溶液；其中染色液中优选的5-氯-8-羟基-喹啉或其衍生物的浓度为62.5μM，优选的乙酸钠-乙酸浓度为5μM，优选的乙醇浓度为30％，优选的染色时间为20min；

5)检测，检测波长为250～370nm，优选为312nm。

本发明方法具有如下优点：

1)操作简单迅速：操作步骤少，可在70min内完成；

2)重现性稳定：受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小；

3)线性关系好：精确，能在较大范围内对蛋白质进行半定量测定；

4)使用安全、环保、低毒；

5)专属性强；

6)成本低。

附图说明

图1. 5-氯-8-羟基-喹啉的化学结构；

图2. 5-氯-8-羟基-喹啉染色法和其他常用染色法灵敏度和特异性的比较。其中(A)为5-氯-8-羟基-喹啉染色法，(B)为Stains-all染色法，(C)为Pro-Q Diamond染色法，(D)为SYPRO Ruby染色法，(E)为CBBR染色法。磷酸化蛋白质为商品化标准品，从上至下分别为牛血清白蛋白(BSA，非磷酸化蛋白)，卵白蛋白(OVA，磷酸化蛋白)，α-酪蛋白(α-casein，磷酸化蛋白)，β-酪蛋白(β-casein，磷酸化蛋白)，κ-酪蛋白(κ-casein，磷酸化蛋白)和肌红蛋白(myoglobin，非磷酸化蛋白)。蛋白质载样量(从左至右，每条带)如下：2000，1000，500，250，125，62.5，32，16，8，4ng。