[发明专利]一种虾青素十六碳二烯酸单酯的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制剂技术领域，尤其涉及一种虾青素十六碳二烯酸单酯的制备方法。

背景技术

雨生红球藻是一种广泛分布于自然界的淡水藻，属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属。雨生红球藻通常只有处于胁迫条件时才开始积累虾青素，以渡过不利的环境条件。关于雨生红球藻积累虾青素的营养盐及环境条件的研究表明，当其处于氮饥饿、高光强等条件下时，能够大量积累虾青素。近年来，光生物反应器技术的发展大大促进了雨生红球藻的养殖及虾青素的积累，应用这种技术可使藻体中虾青素含量达到干重的1.5-3%。

从雨生红球藻中提取虾青素的方法多种多样，欧阳琴等对雨生红球藻厚壁孢子细胞的几种常用机械破壁方法的工艺条件分别进行研究，分别比较了几种不同破壁方法对破壁率和虾青素提取率的影响，结果表明高压均质法最适合于雨生红球藻中厚壁孢子的破碎和虾青素的提取，氯仿:乙醇（1:1，v/v）的混合溶剂最有利于从雨生红球藻孢子态细胞中提取出虾青素。Dong等人比较了4种不同的方法从雨生红球藻中提取虾青素，结果表明盐酸破壁后用丙酮提取的得率最高，且这种方法得到的粗提物的DPPH自由基清除能力也最高。周锦珂以雨生红球藻粉为原料利用纤维素酶对雨生红球藻进行酶解处理，然后用乙醇提取虾青素，在最佳条件下虾青素的提取率高达94.6%。

虾青素末端环状结构中各有一个羟基（-OH），这种自由羟基可与脂肪酸形成酯，雨生红球藻中的虾青素多数以酯的形式存在。如果其中一个羟基与脂肪酸成酯，称虾青素单酯；如果两个羟基都与脂肪酸成酯，则称为虾青素双酯。在鱼类吸收和色素沉积方面，虾青素酯和游离虾青素在生物利用方面差别很小。由于能够与虾青素酯化形成虾青素单酯和双酯的脂肪酸种类繁多，而且虾青素酯的极性比虾青素更小，且各类虾青素酯的结构极性相近，很难将单独一种虾青素酯分离纯化出来；采用传统柱层析法分离纯化虾青素酯，耗时长且得率很低，不利于大量制备纯的虾青素酯。因此，对虾青素酯分离纯化的研究鲜见报道。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种虾青素十六碳二烯酸单酯的制备方法，本案由此产生。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种虾青素十六碳二烯酸单酯的制备方法。

为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种虾青素十六碳二烯酸单酯的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、粗提液的制备：

用天平称取5.0 g雨生红球藻藻粉，加入浓度为0.5-0.7 mg/mL的纤维素酶液200 mL，酶反应pH为4.0-5.0，在45-50 ^oC的条件下破壁25-30 min，然后在5000 rpm条件下离心5 min，弃上清后，将500 mL的丙酮加入藻粉中，浸提40 min，再次离心后，弃去下层沉淀，制得粗提液；将所述粗提液浓缩蒸干，充氮，于-20 ^oC条件下保存，备用；

步骤二、溶剂系统的建立：

按体积比4:1:2配制正己烷-乙腈-甲醇溶剂系统；分别按照上述比例配制溶剂系统溶液1500 mL，置于分液漏斗中，剧烈振荡充分混合后静置分层，平衡后将上下两相分开，以下相作为流动相，上相作为固定相，在使用前上下相分别超声脱气30 min；

步骤三、高速逆流色谱纯化：

打开泵，将超声脱气后的上相作为固定相以30 mL/min的流速泵入到高速逆流色谱仪中，直至上相充满整个HSCCC分离管中，暂停泵，将进液端放到流动相的试剂瓶中，打开主机的电源，设定转速850r/min，启动泵；在出液端用干净的量筒接液，在474nm波长下采集数据，收集洗脱时间为31-40min的目标成分，初步用TLC分析流出物，合并相同组分，制得化合物，即虾青素十六碳二烯酸单酯。

作为实施例的优选方式，还包括步骤四、纯化物的鉴定：采用高效液相色谱HPLC法或采用ESI-MS法分析所述化合物，或采用高效液相色谱HPLC法分析皂化后的所述化合物。

作为实施例的优选方式，所述采用高效液相色谱HPLC法：将所述化合物配成2 mg/mL的样品溶液，高效液相的条件：进样量5 μL，柱温35 ^oC，检测波长474 nm，流速0.2 mL/min；分析所述化合物的保留时间和特征吸收峰，判断所述述化合物的保留时间是否为44.5min，特征吸收峰是否为408nm。