[发明专利]一种exosome来源的与肝癌相关的miRNA标志物及其应用

权利要求书

1.一种与肝癌相关的miRNA标志物及其在诊断人类肝癌中的用途，其特征在于，所述miRNA标志物为肿瘤源性的exosome来源的miRNA-46a，其序列为：5’-UUCAUUCAUUACUUUUGUACGC-3’。

2.一种检测权利要求1所述miRNA标志物的试剂，其特征在于，所述试剂是用于扩增所述miRNA-46a的引物对，或者是用于检测所述miRNA-46a的探针；优选地，用于扩增所述miRNA-46a的正向引物为：5’-actcaccagctggccattattacttttggta-3’，反向引物为：5’-cgccgcagtgcgtgtcgtggagt-3’。

3.一种诊断人类肝癌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的试剂，优选地，还包含PCR反应常用的试剂和酶。

4.权利要求2所述的试剂在制备用于诊断人类肝癌的试剂盒中的用途。

5.权利要求2所述的试剂在诊断人类肝癌中的用途。

6.一种检测权利要求1所述的miRNA标志物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)分离纯化血液中肿瘤源性的exosome；

(2)提取样本总RNA；

(3)将步骤(2)获得的RNA逆转录成cDNA；

(4)在荧光实时定量PCR仪上将步骤(3)获得的cDNA和参照基因进行扩增检测；

(5)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量；

优选地，所述步骤(4)中对cDNA进行扩增检测时所用的正向引物为：5’-actcaccagctggccattattacttttggta-3’，反向引物为：5’-cgccgcagtgcgtgtcgtggagt-3’。

7.权利要求6所述的方法在诊断人类肝癌中的用途。

8.一种从少量血清中快速提取exosome的试剂，所述试剂是用于沉淀exosome的聚合物，优选地，所述试剂是北京捷腾生物科技公司的GenExo混合试剂。

9.一种从少量血清中快速提取exosome的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求8所述的试剂；优选地，所述试剂盒还包含用于进一步纯化分离exosome的层析柱；更优选地，所述试剂盒还包括健康人血清exosome标准品或/对照品。

10.一种利用权利要求9所述的试剂盒从血液中提取exosome的方法，包括：

1)取1ml样本血浆，3000×g离心15分钟，吸取上清；

2)根据北京捷腾生物科技公司提供的GenExo exosome提取试剂盒的使用说明，将上清移入离心管中，按照1∶1的比例在上清中加入GenExo试剂，室温下静置反应5分钟；

3)收集沉淀物；

4)加入100μl样本缓冲液充分混合震荡，然后加入层析管中，1500×g离心5分钟，收集流出液；-80℃保存。