[发明专利]一种用于酿酒酵母电转感受态细胞的制备的重悬液及酿酒酵母电转感受态细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于酿酒酵母电转感受态细胞的制备的重悬液及酿酒酵母电转感受态细胞的制备方法。

背景技术

经过处理后可以摄取外源DNA，处于这种状态的细胞称为“感受态细胞”。在微生物学、分子生物学、基因工程等研究领域，经常要使用各种感受态细胞进行DNA的转化操作。

感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。常用的感受态细胞的制备方法有氯化钙法、Hanahan和Inoue法。氯化钙法是目前实验室制备感受态细胞的常规方法，该方法简便易行，但制备的感受态细胞转化效率较低，只能满足常规分子生物学实验需求；Hanahan法对操作人员的技巧、细心程度和试剂纯度要求较高，可重复性低；Inoue法虽然感受态细胞的转换效率高，但对细菌的OD₆₀₀值要求比较严格，并且培养温度是18℃，细菌在此温度下生长缓慢，培养时间较长，过程相对繁琐。

并且，目前的酵母电转感受态细胞都是现做现用，每次制备需要花费较多的时间和经历，做完的电转感受态细胞冻存后失去活性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种用于酿酒酵母电转感受态细胞的制备的重悬液及酿酒酵母电转感受态细胞的制备方法，由该方法制备的酿酒酵母电转感受态细胞能够长期冻存。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种用于酿酒酵母电转感受态细胞的制备的重悬液，所述的重悬液包括5～15mM的甘氨酸-NaOH缓冲液、占所述的重悬液总体积1～5％的乙二醇、占所述的重悬液总体积2～8％的二甲基亚砜、0.5～1.5M的山梨醇。

优选地，所述的重悬液包括9～11mM的甘氨酸-NaOH缓冲液、占所述的重悬液总体积2～4％的乙二醇、占所述的重悬液总体积4～6％的二甲基亚砜、0.9～1.1M的山梨醇。

进一步优选地，所述的重悬液包括9.5～10.5mM的甘氨酸-NaOH缓冲液、占所述的重悬液总体积2.85～3.15％的乙二醇、占所述的重悬液总体积4.75～5.25％的二甲基亚砜、0.95～1.05M的山梨醇。

本发明的另一个目的是提供一种酿酒酵母电转感受态细胞的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)、将酿酒酵母菌液于YPD固体培养基上培养8～24小时；

步骤(2)、从步骤(1)的YPD固体培养基上挑取单克隆，将所述的单克隆溶于YPD液体培养基中摇床培养8～24小时；

步骤(3)、将步骤(2)培养得到的菌液转接到YPD液体培养基进行扩大培养至菌液的A₆₀₀为0.8～1.0；

步骤(4)、将步骤(3)培养得到的菌液以450～550×g离心4～6min收集菌体；

步骤(5)、向步骤(4)收集的菌体中加入预先冰浴的权利要求1至3中任一项所述的重悬液和0.5～1.5M的二硫苏糖醇进行重悬，然后孵化4～6min；

步骤(6)、将步骤(5)得到的混悬液以450～550×g离心4～6min，收集菌体，然后用0.1～0.3倍的所述的重悬液进行重悬，然后分管冻存。

优选地，采用0.2倍的所述的重悬液进行重悬。

具体地，步骤(1)中，在恒温培养箱中在28～30℃下进行培养。

具体地，步骤(2)中，在28～30℃下以100～200转/分钟的速度进行摇床培养。

具体地，步骤(3)中，在28～30℃下，在保证足够的空气的情况下，以100～120转/分钟的速度进行摇床培养。

具体地，步骤(2)中的YPD液体培养基的体积为4～6mL，步骤(3)中的YPD液体培养基的体积为40～60mL。

具体地，步骤(5)中，所述的重悬液的体积为8～10mL，二硫苏糖醇的体积为0.5～1.5mL。

具体地，步骤(5)中，在孵化器上以90～110rpm的转速、28～30℃下进行孵化。

由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明解决了现有技术中的酿酒酵母感受态细胞不可冻存的问题，本发明中的酿酒酵母感受态细胞冻存后效价衰减较弱，能够满足实验需求，从而能够长期冻存，无需现配先用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。本发明中若无特别说明，原料均可市购获得，方法为本领域的常规方法。

实施例1：