[发明专利]具有强寄生广谱病原真菌的哈茨木霉工程菌株的构建及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株强寄生广谱病原真菌的哈茨木霉工程菌株的构建及其应用，属于应用微生物技术领域。

技术背景

重寄生是指一种真菌捕食或者寄生另外一种真菌，获取营养，满足自身的生长繁殖；当被捕食的或被寄生的是植物病原真菌，可以抑制病原真菌的生长繁殖，达到生物防治植物真菌病害的效果。研究和应用最广泛的真菌杀菌剂是在根际有较强竞争能力的木霉(Trichoderma spp.)，因为其能重寄生植物病原真菌，减轻真菌引起的病害；定殖植物根际，活化养分，促进植物生长，提高经济作物产量。

已登记的木霉制剂，主要用于土壤处理(与各种肥料混合施用)和种子处理(种子包衣)。由于土壤和作物种类的差异、土壤温度、湿度的变化以及土著微生物的存在显著影响着外源木霉的定殖，严重制约了功能木霉的进一步应用。哈茨木霉(Trichoderma harzianum)SQR-T037是我国科学家分离得到并已实现商品化应用的一株兼具生防和促生功能的植物有益菌，田间应用效果并没有实验室条件下那么稳定。因此，随着SQR-T037基因组的测序完成，研究木霉重寄生病原真菌的关键基因，通过遗传改造，获得稳定遗传的工程菌株，增强木霉重寄生土壤病原真菌能力，提高木霉生防效果，对木霉及其相关产品的意义重大。因此，研究木霉菌中与生防相关基因的功能，对明确其的生防机制和改良菌种都具有重要的理SQR-T037论意义。

活性氧类(Reactive oxygen species,ROS)，是指在生物体内与氧代谢有关的含氧自由基和易形成自由基的过氧化物的总称，机体内氧化代谢可不断形成活性氧，在一定的空间、时间和一定的限度内活性氧有积极的生理作用。早期研究表明，产生ROS是植物、动物重要免疫防御反应之一，参与多种信号传导。目前研究最为深入的是哺乳动物gp91^phnox，巨噬细胞接触病原细菌后，活性氧剧增，超氧化物、过氧化氢可以直接杀死病原细菌或者激发多种蛋白酶；功能分析真菌gp91^phnox的同源蛋白Nox1，对菌丝的繁殖和防御有重要影响。敲除Aspergillus nidulans的基因nox1无法形成子实体，阻止该菌的有性生殖。敲除Podospora anserina和Neurospora crassa中nox1，有同样的现象。NOX介导的ROS系统同样也影响真菌自我防御机制，识别非自身的菌丝体。本发明从活性氧H₂O₂为出发点，发掘木霉重寄生病原真菌的关键基因，并且构建强寄生病原真菌的工程菌株，满足农业生产运用需求。

发明内容

本发明发现了参与调控哈茨木霉重寄生病原真菌过程的相关核心基因；

本发明的另一目的在于构建一种强寄生多种病原真菌的工程菌株，提高木霉在农业生产中防治病害效果，促进以功能木霉为主的微生物菌肥中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的Nox1基因在调控木霉重寄生病原真菌中的应用。

一种构建过表达nox1重组质粒的方法，该构建方法为：构建以pcDNA1为强启动子的过量表达载体，以引物扩增H₂O₂合成的相关编码基因cDNA及基因的下游500bp序列，然后将扩增产物分别插入质粒pPcdna1-cel7b中ClaI位点和SalI位点，得到过量表达nox1重组质粒。所述H₂O₂合成的相关编码基因为Nox1基因。优选的，以哈茨木霉SQR-T037的基因组DNA为模板以引物infu-ter-fw(SEQ ID NO.2)和infu-ter-rev(SEQ ID NO.3)扩增基因nox1下游500bp为终止子；设计引物Infu-nox-fw(SEQ ID NO.4)和infu-nox-rev(SEQ ID NO.5)从哈茨木霉SQR-T037 cDNA中扩增nox1的cDNA。

采用上述方法构建的过表达nox1重组质粒。