[发明专利]一种杉木原生质体的制备及纯化方法

权利要求书

1.一种杉木原生质体制备及纯化方法，其特征在于，其包括如下步骤：

1)选取杉木组培苗最上部未分轮的叶片和/或幼嫩茎段；将叶片或茎段切断，放入酶解液中，抽真空，置于水平摇床上黑暗酶解，酶解温度为25～27℃，酶解时间为2h；

2)用孔径70μm的细胞筛将酶解液过滤至离心管中，用原生质体清洗液清洗酶解后的叶片和/或茎段，用70μm的细胞筛进行过滤，滤液合并至同一离心管中，离心去上清；向沉淀中加入预冷的所述原生质体清洗液清洗原生质体，离心去上清后再用预冷的所述原生质体清洗液重复洗一次，收集的沉淀用原生质体重悬液重悬，再用70μm细胞筛过滤重悬的沉淀，得到纯化的杉木原生质体，

所述酶解液按如下方式制备：将1.5％纤维素酶，0.4％果胶酶，1％离析酶，0.5M甘露醇，20mM KCl溶于20mM MES，水浴10min，冷却后加入10mM CaCl₂，0.1-0.2％BSA。

2.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法，其特征在于，步骤1)将叶片或茎段切成0.5-1.5mm*0.5-1.5mm的小片或小块。

3.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法，其特征在于，摇床转速为100-180rpm。

4.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法，其特征在于，所述叶片或茎段放入酶解液中抽真空，时间为30-60min。

5.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法，其特征在于：所述原生质体清洗液为：150mM NaCl，120mM CaCl₂，5mM KCl，2mM MES，pH 5.7。

6.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法，其特征在于：所述原生质体重悬液为：0.5M甘露醇，4mM MES，15mM MgCl₂，pH 5.7。