[发明专利]一种杉木原生质体的制备及纯化方法

说明书

本发明公开了一种杉木原生质体制备及纯化方法。选取杉木组培苗最上部未分轮的叶片或幼嫩茎段；将叶片或茎段切断，放入酶解液中，抽真空，置于水平摇床上黑暗酶解2‑4h；用孔径70μm的细胞筛将酶解液过滤至离心管中，用原生质体清洗液清洗酶解后的叶片或茎段，用70μm的细胞筛进行过滤，滤液合并至同一离心管中，离心去上清；向沉淀中加入预冷的所述原生质体清洗液清洗原生质体，离心去上清后重复洗一次，收集的沉淀用原生质体重悬液重悬，得到纯化的杉木原生质体。本发明得到杉木叶片原生质体的产量为1.8×10⁶个/g，活力为94％；杉木茎段原生质体的产量为8.9×10⁵个/g，活力为86.5％，获得的原生质体产量大、活力高。

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种杉木原生质体的制备及纯化方法。

背景技术

杉木(Cunninghamia lanceolata)为杉科杉木属乔木，是我国华南地区的重要速生用材树种之一。然而，杉木在遗传转化方面一直没有突破与进展。研究表明，原生质体由于没有细胞壁，可相对容易摄取外源遗传物质，是进行遗传转化的理想受体。

木本植物中，柑橘最先获得原生质体。目前，已有一些木本植物的原生质体分离及纯化获得成功，但绝大多数尚未建立系统、完整、成熟的原生质体分离及纯化技术体系。杉木组培苗叶片或茎段原生质体的分离方法目前尚未有见报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种杉木原生质体制备及纯化方法，其包括如下步骤：

1)选取杉木组培苗最上部未分轮的叶片或幼嫩茎段；将叶片或茎段切断，放入酶解液中，抽真空，置于水平摇床上黑暗酶解2-4h；

2)用孔径70μm的细胞筛将酶解液过滤至离心管中，用原生质体清洗液清洗酶解后的叶片或茎段，用70μm的细胞筛进行过滤，滤液合并至同一离心管中，离心去上清；向沉淀中加入预冷的所述原生质体清洗液清洗原生质体，离心去上清后再用预冷的所述原生质体清洗液重复洗一次，收集的沉淀用原生质体重悬液重悬，再用70μm细胞筛过滤重悬的沉淀，得到纯化的杉木原生质体。

其中，步骤1)将叶片或茎段优选切成0.5-1.5mm*0.5-1.5mm的小片或小块。

其中，摇床转速优选为100-180rpm。

其中，所述酶解液按如下方式制备：将1.5％纤维素酶，0.4％果胶酶，1％离析酶，0.5M甘露醇，20mM KCl溶于20mM MES，水浴10min，冷却后加入10mM CaCl₂，0.1-0.2％BSA。

其中，所述叶片或茎段放入酶解液中抽真空(150mbar)，时间为30-60min。

其中，优选酶解温度为25～27℃，优选的酶解时间为2h。

其中，所述原生质体清洗液优选为：150mM NaCl，120mM CaCl₂，5mM KCl，2mM MES，pH 5.7。

其中，所述原生质体重悬液优选为：0.5M甘露醇，4mM MES，15mM MgCl₂，pH 5.7。

本发明的有益效果是：(1)利用组培苗的叶片或茎段制备原生质体，不需对材料消毒而且材料容易获得；(2)针对杉木叶片的特性建立了相应的酶解体系和处理方法，获得的原生质体产量大、活力高；(3)纯化方法简单、易于操作且可减少细胞碎片等杂质，获得了较高纯度的原生质体；(4)本发明对木本植物提取原生质体具有一定的借鉴意义。

附图说明

图1A为50mm下杉木叶片分离得到的原生质体。

图1B为50mm下杉木叶片经FDA染色后的发绿色荧光的原生质体。