[发明专利]基于重组载体pGPE57的重组菌株E.coliGPE10及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组载体pGPE57和重组菌株E.coli GPE10及其构建方法和应用，将带有同源序列的线性DNA片段导入E.coli GPE10感受态细胞中完成DNA组装，属于生物技术领域。

背景技术

DNA克隆和组装技术是分子生物学实验室的最常用工具之一。近年来，随着后基因组时代的到来，生命科学领域快速发展，在合成生物学方面来分析基因功能、调控基因元件和探索生物途径也不断深入，利用分子克隆技术来组装DNA元件就显得尤为关键。传统的酶切连接法是应用最广泛的分子克隆技术，然而这一方法局限于酶切位点的选择，且操作繁琐，耗时耗力。随着分子克隆技术的发展，一些简单高效的基因克隆方法也已近问世，如gateway重组克隆技术(Katzen F. recombinational cloning:a biological operating system[J].Expert opinion on drug discovery,2007,2(4):571-589.)和Gibson连接法(Gibson D G,et al.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases[J].Nature methods,2009,6(5):343-345.)。比如，gateway克隆技术是利用特异位点的重组技术把供体载体的目的基因转移到目的载体上，过程繁琐，且需要抗ccdB的特殊菌株来转化。对于Gibson连接法，则需要一系列酶来参与连接反应，同时，需要体外50度连接1h，既耗费时间，又浪费金钱。

来自λ噬菌体的Red同源重组系统主要由Exo、Beta、Gam等一系列蛋白组成(Datsenko K A,Wanner B L.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2000,97(12):6640-6645.)，Red系统对于线性和环形同源重组具有较高的效率，但在线性片段的重组上则有些不足。

发明内容

针对分子克隆中的实际问题和需求，本发明提供了一种重组载体pGPE57，为将pKD46质粒中的bet元件替换成pfu-Ssod7DNA序列形成全长序列为SEQ ID NO.17的重组质粒pGPE57。

本发明还提供一种基于上述重组载体pGPE57的质粒pUC-YZ，为将pGPE57质粒中的repA101和OriR101元件替换成LacY、pUC ori、和LacZ DNA序列形成全长序列为SEQ ID NO.18的质粒pUC-YZ。

进一步地，本发明还提供一种基于上述重组载体pGPE57的重组菌株E.coli GPE10，为将上述质粒pUC-YZ整合到DH10B中，形成含有Amp、AraC、Pbad、gam、pfu-Ssod7和exo基因元件的重组菌株E.coli GPE10。

本发明提供上述重组载体pGPE57的构建方法，包括引物设计、基因克隆和载体构建，通过合成引物PCR扩增pfu-Ssod7DNA序列和pKD46目的片段，将pfu-Ssod7DNA序列和pKD46目的片段连接，得到重组质粒pGPE57。

本发明提供上述质粒pUC-YZ的构建方法，包括引物设计、基因克隆和载体构建，通过合成引物PCR扩增LacY、pUC ori、和LacZ和pGPE57目的片段，将LacY、pUC ori、LacZ序列和pGPE57目的片段连接，得到重组质粒pUC-YZ。

本发明提供上述重组菌株E.coli GPE10的构建方法，将酶切后的pUC-YZ质粒转化进DH10B感受态细胞，将Amp、AraC、Pbad、gam、pfu-Ssod7和exo基因元件整合到DH10B基因组上，形成重组菌株E.coli GPE10。

上述重组菌株E.coli GPE10在多片段DNA组装中的应用，包括：经过阿拉伯糖诱导后的E.coli GPE10的感受态细胞，可用于有同源序列的多个PCR扩增产物在E.coli GPE10细胞内直接进行定向DNA组装，也可用于PCR扩增产物和线性化酶切产物在E.coli GPE10细胞内直接进行定向DNA组装，实现分子克隆。