[发明专利]一种逆转录病毒载体介导HSV1的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种逆转录病毒载体介导HSV1的方法，具体地说是以一种逆转录病毒载体介导HSV1的方法。

背景技术

目前公知的肿瘤的基因治疗，特别是自杀基因治疗，已经成为继传统手术切除、放射治疗、化学药物治疗等疗法之后一种新的抗肿瘤治疗措施。目前应用的肿瘤自杀基因治疗系统主要有单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶtk）、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶（ＶＺＶtk）、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＥＣＣＤ）；P53等。单纯疱疹病毒胸苷激酶／丙氧鸟苷（ＨＳＶtk／ＧＣＶ）治疗系统为最常用、最重要的治疗系统之一。

发明内容

诊断标准：

研究对象：材料与方法；pIC19R/MC1tk质粒（克隆了HSV1tk的载体质粒）pLXSN逆转录病毒表达载体、病毒包装细胞PT67均购自美国Clontech公司；人胃癌细胞SGC7901和小鼠NIH3T3细胞均购自中山医科大学细胞库；Ecoli DH5α菌株由本校生化教研室保存。试剂；高纯度质粒提取试剂盒和DNA片段凝胶回收试剂盒均购自上海sangon生物工程技术有限服务公司；DNA片段连接试剂盒，购自广州宝泰克生物科技有限公司；转染试剂盒Polyfect Transfection为QIAGEN公司产品；多聚阳离子（Polybrene）、G418、GCV均为Sigma公司产品；DMEM、胎牛血清和RPMI1640均为Gibco公司产品；新生牛血清为杭州四季青公司产品。质粒的抽提、酶切、DNA片段的连接、转化，按Sambrook法或试剂盒产品说明书的方法进行，提取的质粒DNA浓度与纯度用RNADNA Caculator测定。重组质粒的构建 pIC19R/MCItk质粒和逆转录病毒表达载体pLXSN质粒均转化DH5α后扩增、抽提纯化，均用限制性内切酶EcoR I/Bam H I 酶切，凝胶电泳证实pIC19R/MCItk质粒有17kb HSV1tk cDNA目的片段，回收、纯化此tk基因片段及pLXSN载体双酶切后的大片段，在适当的反应体系中用DNA片段连接试剂盒将tk基因定向克隆入逆转录病毒表达载体pLXSN中，构建成重组的pLXSNtk质粒。限制性内切酶鉴定和序列鉴定，重组质粒经转化、扩增、提纯后，采用EcoR I、BamH I单酶切和EcoR I／BamH I双酶切，酶切后采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，图象分析仪拍照、分析。然后分别在pLXSN载体上单克隆位点中的EcoR I、BamH I酶切位点上下游附近各选23个碱基的片段为测序引物，将新构建pLXSNtk质粒进行测序。细胞培养；包装细胞PT67、小鼠NIH3T3细胞分别培养于含体积分数为10%的新生牛血清的DMEM高糖培养液和RPMI1640培养液中，置于37℃、体积分数为5%的ＣＯ２的培养箱内，25g/L胰酶EDTA消化传代。将细胞置于梯度浓度的G418中，观察细胞对G418敏感性，确定G418筛选浓度：PT67细胞为400mg/L，NIH3T3细胞为300mg/L。PT67的转染及阳性克隆细胞的筛选取4×１０５／孔PT67接种于35mm的6孔培养板，待次日融合率达80%左右时，将25μg的重组质粒DNA用不含血清的培养液稀释至体积为150μL，再加入15μL的PolyFect Transfection试剂混匀，室温放置10min后，再加入1 mL的完全培养液，混匀后，立即把转染混合物转移到PT67细胞的培养板中，培养2d后，用G418（400mg/L）筛选2周，获得抗性细胞集落后，再用25g/L胰酶消化，以1∶１０继续传代，在含500 mg/L以上G418的选择性培养液中分别扩大培养，选择最高抗性克隆留种，命名为PT67／tk细胞；NIH3T3的感染及病毒滴度的测定；收集PT67／tk细胞上清液，以045 μm的过滤器过滤，进行10、10２、１０３、１０４、１０５、１０６倍系列稀释，加入对数生长期NIH3T3细胞，随后加Polybrene至终浓度为8mg/L，2 d后更换含300mg／L G418的选择培养液，连续筛选2周后，观察各稀释度中抗性细胞（NIH3T3/tk）克隆数（m），按“滴度（cfu/mL)=m×稀释度”测定病毒滴度(其中cfu为colony forming units)。人胃癌细胞的感染及GCV对其体外杀伤效应的测定；同上方法感染人胃癌细胞SGC7901，感染后癌细胞用G418筛选2周，获得抗性细胞克隆，命名为SGC7901／tk，将它与SGC7901分别等量接种于24孔板，各12孔，各选6孔分别加入100mg/L的GCV，余下各6孔为不加药对照组，3 d内用台盼蓝染色活细胞计数法计算SGC７９０１／tk―ＧＣＶ、SGC７９０１／tk、SGC７９０１―ＧＣＶ、SGC７９０１共4组活细胞数目，记为n、n０、n′、n′０，按n／n０（n′／n′０）×100％计算生存率pＳr、pＳr′。结果：重组质粒的构建和鉴定；提纯所得质粒DNA的光密度D（260 nm/280 nm）比值为17～22。EcoR I/BamH I双酶切后的pIC19R/MC1tk质粒，经琼脂糖凝胶电泳显示有17kb的DNA片段；逆转录病毒载体pLXSN质粒经EcoR I、BamH I单酶切后显示为59kb的DNA带，新构建的pLXSNtk质粒经EcoR I/BamH I双酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示2条DNA带，分别为17 kb和59kb左右。新构建的pLXSNtk质粒结构，分析测序结果，碱基序列与文献报道一致，证明HSVtk基因已被定向克隆入pLXSN载体中。pLXSNtk转染包装细胞PT67的结果；转染后，用400mg/L的G418筛选2d后，细胞开始死亡，在4～５d内死亡达到高峰，5d后有少数细胞贴壁生长，再过1周，这些细胞逐渐形成阳性克隆细胞团，用最终高达1g/L的G418筛选到的PT67／tk扩大培养后，收集病毒液，感染NIH3T3测定病毒滴度，经测定滴度为4×１０４cfu/mL。