[发明专利]一种针对鱼中生物胺的快速分析方法

权利要求书

1.一种针对鱼中生物胺的快速分析方法，其特征在于：

（1）将鱼肉组织均质化之后，采用5-磺基水杨酸作为提取溶剂，珠打研磨作为提取方法进行生物胺的提取；

（2）将提取后的样品溶液进行稀释之后，加入苯甲酰氯溶液进行衍生，衍生反应在室温条件下涡旋即可完成，待反应结束后，离心，取上清液用于检测分析；

（3）采用液相色谱-三重四级杆质谱联用仪的多反应监测模式进行样本分析；

（4）采用内标法对生物胺衍生物进行定量分析，获得鱼中生物胺的含量；

步骤（1）中将获得的鱼去皮剔骨除内脏后放入料理机中进行粗均质，粗均质转速为10000-20000转/分，均质时间为1-5 min；

实际样品分析：称取20 mg ± 0.5 mg粗均质后的鱼肉组织置于ep管中，依次加入氧化锆小球，300 μL浓度为 5 mg/mL的5-磺基水杨酸溶液，100 μL浓度皆为4.5 μg/mL的1-庚胺和1,7-庚二胺内标溶液，100 μL体积浓度为20%的乙腈溶液，之后采用混合研磨仪在20-25Hz的条件下研磨提取1 min，重复2-4次，研磨提取后的样品立即放入离心机中，在4-10^oC，14000-15000 rpm的条件下离心10-15 min，取离心之后的上清液100 μL置于ep管备用；

和/或，方法验证中回收率、重复性以及日内日间精密度考察：称取20 mg ± 0.5 mg粗均质后的鱼肉组织置于ep管中，依次加入氧化锆小球，300 μL浓度为 5 mg/mL的5-磺基水杨酸溶液，100 μL浓度皆为4.5 μg/mL的1-庚胺和1,7-庚二胺内标溶液，100 μL含9种生物胺的混标溶液，浓度根据实验需要而定，之后采用混合研磨仪在20-25 Hz的条件下研磨提取1 min，重复2-4次，研磨提取后的样品立即放入离心机中，在4-10^oC，14000-15000 rpm的条件下离心10-15 min，取离心之后的上清液100 μL置于ep管备用；

步骤（1 ）中离心之后取的100 μL上清液加入900 μL浓度为50 mM的硼砂缓冲溶液，涡旋1-2 min之后取10 μL，依次加入45 μL浓度为100 mM的硼砂缓冲溶液和45 μL体积浓度为1%的苯甲酰氯乙腈溶液，涡旋10 min后置于离心机在4-10^oC，14000 -15000 rpm的条件下离心10-15 min，然后取上清液用于分析；

步骤（3）中采用液相色谱-三重四级杆质谱联用仪的多反应监测模式进行样本分析；

（a）液相色谱条件：Waters HSS T₃色谱柱 2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm；柱温为60 ℃；流动相：A相为体积浓度0.1% FA（甲酸）的H₂O，B相为体积浓度0.1% FA的ACN（乙腈）；流速设置为0.2 mL/min；总的色谱运行时间为15 min；洗脱梯度为：0 ~ 1 min，2% B（V/V），1 ~ 4min，梯度从2% B（V/V）线性增至30% B（V/V），4 ~ 4.1 min，梯度从30% B（V/V）线性增至50%B（V/V），4.1 ~ 9 min，50% B（V/V），9 ~9.1 min，梯度从50% B（V/V）线性增至95% B（V/V），9.1 ~ 12 min，95% B（V/V），12 ~12.1 min，梯度从95% B（V/V）线性降至2% B（V/V），12.1 ~15 min，2% B（V/V）；色谱分析时，待分析的样品以及流动相在前2 min通过六通阀切进废液，2 ~ 12 min切进质谱，12 ~ 15 min切进废液；进样室温度为4^oC；进样体积为2 μL~10 μL；

（b）质谱条件：ESI源，雾化气、加热气、干燥气的流速分别为3、10、10 L/min；接口温度、DL温度、加热气温度分别为300、250、400^oC；

所述生物胺为胍基丁胺，组胺，酪胺，精胺，亚精胺，2-苯乙胺，色胺，尸胺，腐胺。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤（3）中采用多反应监测模式分析样本；优化多反应监测模式的方法，挑选响应最高的离子对作为定量离子对，响应次之的离子对作为辅助定性离子对。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤（4）中采用内标法定量，根据线性定量曲线进行定量检测分析。