[发明专利]一种利用发夹引物进行多重PCR的方法

权利要求书

1.一种利用发夹引物进行多重PCR的非疾病的诊断与治疗方法，其特征在于，与目标区段序列特异性配对的引物是发夹引物，所说发夹引物的3’端与目标区段序列特异性配对，发夹引物的5’端与3’端序列配对，所说发夹引物的解链温度不低于80℃，且低于多重PCR的变性温度，所说发夹引物除5’端与3’端配对序列之外的环部为通用序列，在同一PCR反应中的上下游发夹引物数为两对或者两对以上，所说的发夹引物3’末端的碱基与5’末端的碱基互补配对，以使所说的发夹引物5’末端和3’末端封闭。

2.一种权利要求1所述方法的试剂盒，包括多对所说的发夹引物。

3.一种利用发夹引物构建二代测序平台文库的非疾病的诊断与治疗方法，包括如下步骤：

(1)在针对目标区段设计的特异引物序列的上下游5’端分别添加上游通用序列和下游通用序列，并在通用序列5’端各添加与目标区段3’端部分序列完全互补配对的序列，使解链温度不低于80℃，获得末端封闭的上下游发夹引物；

(2)第一轮PCR反应，利用多对上下游发夹引物对目标区段进行10-30个循环的扩增；

(3)设计接头引物，包括三部分序列，从5’端开始依次为二代测序接头引物、条形码序列、和通用序列；其中，每一对接头引物的条形码序列不同，以区分不同模板；

(4)利用第一轮PCR扩增产物的原液或者稀释液为模板，添加上下游接头引物进行第二轮PCR反应，将不同样本所获得的第二轮扩增产物混合，即可构成二代测序平台文库。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的第一轮PCR反应进行15-25个循环。

5.一种权利要求3所述方法的试剂盒，包括多对所说的发夹引物和接头引物。